Name: جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: تعلم تقنية التطعيم الجنيني لإنتاج أطراف هابلويد متحولة في الأناكسولوت لدراسة التجدد والفحص الوراثي. تتيح هذه الطريقة للباحثين استكشاف آليات الجينات في البرمائيات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر (كاثرين روبرتس) على رعايتها لمستعمرة (أكسولوتل) تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي للابتكارات في ولاية كونيتيكت (15RMA-YALE-09 و 15-RMB-YALE-01) ومعهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (ما بعد الدكتوراه الفردية زمالة F32HD086942).

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة ييل (IACUC، 2017-10557) وكانت متفقة مع جميع السياسات والمبادئ التوجيهية الاتحادية التي تحكم استخدام الحيوانات الفقارية. أجريت جميع التجارب على الحيوانات على Ambystoma mexicanum (axolotls) في مرافق في جامعة ييل.
1. جيل الأجنة الديلويد
<ol><li>الحصول على GFP + الأجنة diploid لتكون بمثابة المضيفين الكسب غير المشروع من خلال التزاوج الطبيعي باستخدام واحد أو اثنين من الآباء gfp 24.</li>
	<li>جمع البيض الديبلويد وضعت حديثا ووضعها في منخل معدني.</li>
	<li>شطف البيض جيدا مع محلول هولترريتر 40٪ (20 mM NaCl، 0.2 mM KCl، 0.8 mM NaHCO3،0.2 mM CaCl2،4 mM MgSO4،درجة الحموضة إلى 7.4).</li>
	<li>ضع البيض في محلول هولتفريتر الطازج بنسبة 40٪ وخزنه عند درجة حرارة 12 درجة مئوية. ملاحظة: يجب دائما الحصول على أجنة الدوبلويد قبل الانتقال إلى توليد الأجنة هابلويد.</li>
</ol>2. توليد الأجنة Haploid
<ol><li>الإناث إعداد المانحين gamete<ol>
<li>48 ح قبل إجراء في تنشيط المختبر، وجنسة الناضجة جنسيا الأبيض أو الأبيض / RFP الإناث axolotl عن طريق الغمر في 1 ز / L HEPES العازلة MS-222 في 40٪ حل Holtfreter25.</li>
		<li>تأكد من أن يتم تم تهيأ الحيوان بالكامل بعد ما يقرب من 30 دقيقة من الغمر عن طريق قرص ذيله بقوة بين الإبهام والسبابة. لن تستجيب الحيوانات المحملة بالكامل فعليًا لأي قرصة.</li>
		<li>إعداد حل من gonadotropin المشيمي البشري (HCG) التي تحتوي على 10،000 U / مل في المالحة المعقمة.</li>
		<li>باستخدام حقنة الأنسولين 30 G، حقن 0.15 CC من قوات حرس السواحل الهايتية (1500 وحدة) في الظهرية العضلية إلى الطرف الخلفي للأنثى بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط لتجنب ملامسة الحبل الشوكي.</li>
		<li>أعد الأنثى إلى محلول Holtfreter الطازج بنسبة 40٪ وضعها في ثلاجة 8-12 درجة مئوية.</li>
		<li>بعد 48 ساعة، أعد الأنثى إلى درجة حرارة الغرفة. وضع بعض الحجارة أو النباتات البلاستيكية في حاويتها كأسطح لوضع البيض. ملاحظة: الإناث حقن مع قوات حرس السواحل الهايتية سوف إيداع حالات هلام فارغة في كثير من الأحيان لعدة ساعات قبل وضع البيض.</li>
		<li>إزالة الحجارة أو النباتات البلاستيكية بعد أن بدأت الأنثى باستمرار وضع البيض.</li>
		<li>السماح للأنثى للالجلوس في خزان فارغ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. ملاحظة: حجب المواد للمنال لوضع البيض على سيسمح تشديد السيطرة على جمع البويضات.</li>
	</ol></li>
	<li>مجموعة من الرُمّية<ol>
<li>في حين أن وضع بويضة الأنثى متوقف ، يتم تحديد جنس GFP + axolotl الذكور الناضج جنسيًا ليكون بمثابة متبرع بالحيوانات المنوية ، كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.</li>
		<li>وضع الذكور بولاية كاملة على ظهره على مناشف ورقية رطبة تحت المجهر تشريح.</li>
		<li>إذا كان المجرب هو اليد اليمنى، ضع طرف ماصة P1000 في قاعدة الكلوكا باليد اليمنى.</li>
		<li>ضع السبابة اليسرى وإبهام اليد اليسرى 2−3 سم على الحوض. ضغط بلطف على الحيوان أثناء تحريك الأصابع نحو الساقين الخلفيتين لطرد عينات البول المنوية.</li>
		<li>جمع كل ما يتم مسح من cloaca في أنبوب microcentrifuge الفردية. كرر هذه العملية لجمع 6 إلى 10 عينات.</li>
		<li>ماصة 5.0 μL من كل عينة على طبق بتري لفحص نوعية الحيوانات المنوية باستخدام المجهر مقلوب. ملاحظة: عينات الحيوانات المنوية المركزة هي لون أبيض حليبي، وعادة ما تتراوح بين 5 إلى 20 ميكرولتر، وعادة ما يتم استردادها بعد عدة، يتم استخراج عينات البول الحيوانات المنوية أعلى حجم. سوف الحيوانات المنوية جمع في الجزء السفلي من الأنابيب في عينات حجم أعلى عندما تركت دون عائق. عينات مركزة من الحيوانات المنوية صحية هي كبيرة والمتحركة وتفقد النشاط مع انخفاض تركيزها. يمكن للذكور الأصحاء إنتاج ما يصل إلى 50 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المركزة.</li>
	</ol></li>
	<li>مجموعة الإناث gamete<ol>
<li>بعد الحصول على عينة الحيوانات المنوية صحية وتأكيدها، وحقن HCG أنثى axolotl كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.</li>
		<li>وضع الأنثى المحملة بالنساء بشكل كامل على مناشف ورقية رطبة على ظهرها.</li>
		<li>استخراج البويضات غير المخصبة من الأنثى باستخدام حركة اليد مماثلة لتلك الموجودة في الخطوة 2.2.4.</li>
		<li>جمع البيض باستخدام ملقط الرطب ونقلها إلى طبق بيتري 10 سم. علاج البيض مع الحيوانات المنوية المشععة في غضون 15 دقيقة من جمع.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد ألعاب الذكور وتفعيل المختبر<ol>
<li>استخدام P10 أو P20 ماصة لpipette الحيوانات المنوية صعودا وهبوطا، وكسر كتل لتشكيل تعليق متجانسة.</li>
		<li>تقريب النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة عن طريق وضع قطرة 0.5 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية غير المخفف على غطاء طبق بتري أو شريحة زجاجية والفحص بمجهر مقلوب.</li>
		<li>إضافة 9.5 ميكرولتر من 0.1x مارك تعديل حل رينغر (MMR; جدول المواد) إلى هذه العينة لجعل تخفيف الحيوانات المنوية 20x. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط.</li>
		<li>مع المجهر المقلوب، عد الحيوانات المنوية في ثلاث قطرات 1.0 ميكرولتر من aliquot 20x المخفف على غطاء طبق بتري أو مقياس الهيوكتومتر لتقدير تركيز الحيوانات المنوية من تعليق غير مخفف.</li>
		<li>إعداد الحيوانات المنوية للتشعيع عن طريق تخفيف aliquot من عينة الحيوانات المنوية الأصلية إلى حوالي 80،000 الخلايا المتحركة / مل في 0.1x MMR المعقمة.</li>
		<li>عد عدد البويضات التي تم الحصول عليها خلال الـ 15 دقيقة الماضية. أضف 0.5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المخففة الطازجة من الخطوة 2.4.5 لكل بويضة إلى طبق بتري. استخدم طرف الماصة لنشر هذا التعليق في طبقة سميكة 1 مم.</li>
		<li>باستخدام رفع من البلاستيك، ضع العينة 4 سم من المصابيح من 254 نانومتر crosslinker. تعطيل الحيوانات المنوية وراثيا عن طريق تشعيع العينة مع 800،000 uJ/mm2.</li>
		<li>باستخدام ماصة P10، ماصة التعليق على البيض غير المخصبة، وطلاء كل بويضة مع 0.25-0.5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المشععة. السماح للبيض للالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>بعد 30 دقيقة، تغمر البيض بـ 0.1x MMR. ضع البيض على الفور في حاضنة 8-10 درجة مئوية للحقن في اليوم التالي أو عند 18 درجة مئوية للحقن في غضون 7 ساعات بعد التنشيط (hpa).</li>
		<li>Dejelly haploids باستخدام ملقط حادة 30 دقيقة بعد الترطيب. ضع البيض على الفور في حاضنة 8-10 درجة مئوية للحقن في اليوم التالي أو عند 18 درجة مئوية للحقن في نفس اليوم.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Haploid Mutagenesis والصيانة
<ol><li>حقن ميكروفير/كاس9<ol>
<li>تصميم sgRNAs باستخدام CRISPRscan وتوليف26،27.</li>
		<li>بالنسبة للطفرات المتعددة الطفرات، قم بإعداد مخزون من 5 sgRNAs (10 نانوغرام/ميكرولتر لكل sgRNA) وبروتين Cas9 (1 ميكروغرام/ميكرولتر). إعداد تخفيف 100 مرة من هذا المخزون (0.1 نانوغرام / ميكرولتر لكل sgRNA، 10 نانوغرام / μL Cas9) للحقن. لجين واحد، طفرة عالية التردد mutagenesis، اتبع البروتوكول المبين سابقا28.</li>
		<li>حقن الأجنة الهابلويد في مرحلة الخلية الواحدة 7 hpa إذا تم تخزينها في 18 درجة مئوية أو حقن الأجنة في اليوم التالي في مرحلة الخلية 2-8 إذا تم تخزينها في 8-10 درجة مئوية.</li>
		<li>نقل الأجنة إلى 1.0x MMR مع 20٪ من البوليسوكروز 400.</li>
		<li>إذا كانت خلية واحدة، حقن كل جنين مع قطرة 5 مل من محلول الحقن (حوالي 1/4 نصف قطر من البيضة) التي تحتوي على كتلة إجمالية من 0.5 pg/sgRNA و 50 PG Cas9 البروتين. إذا كانت متعددة الخلايا، قم بتوزيع هذه الكتلة عن طريق حقن وحدات تخزين أصغر في خلايا متعددة.</li>
		<li>السماح للأجنة للشفاء في البوليسوروز 400 لمدة لا تقل عن 4 ساعة والحد الأقصى من 18 ساعة في 18 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إسكان جنين هابلويد<ol>
<li>نقل الأجنة إلى 0.1x MMR مع مضاد المضادات الحيوية.</li>
		<li>منزل كل جنين في بئر الفردية من لوحة 24 جيدا، كما أن البعض سوف يموت أو تتطور بشكل غير طبيعي. الحفاظ على 16-18 درجة مئوية. يمكن استخدام درجات حرارة أقل لإطالة أمد التطور، إذا لزم الأمر.</li>
		<li>استبدال وسائل الإعلام مع MMR الطازجة 0.1x مع مضاد المضادات الحيوية كل يومين.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Diploid إعداد الجنين المضيف
<ol><li>الحفاظ على الأجنة في طلاء هلام في 12 إلى 16 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة 22 إلى 26.</li>
	<li>جمع الأجنة التي هي جاهزة للتطعيم، ووضعها داخل منخل (4 ملم حجم شبكة)، وشطف بلطف لهم مع محلول Holtfreter 40٪.</li>
	<li>نقل الأجنة إلى 0.1x MMR المعقم مرشح يحتوي على 1.5٪ التبييض لمدة تصل إلى 2 دقيقة. غمر تماما الأجنة في محلول التبييض ودوامة لهم بلطف لضمان أن طلاء هلام يجعل الاتصال الكامل مع محلول التبييض لقتل الميكروبات موجودة على الأجنة.</li>
	<li>بعد 2 دقيقة، تمييع محلول التبييض الذي يحتوي على الأجنة بحجم متساوٍ من التعقيم بالفلتر 0.1x MMR.</li>
	<li>صب بلطف الأجنة في منخل مطهر التبييض (4 مم حجم شبكة) وشطف الأجنة خمس مرات مع مرشح تعقيم 0.1x MMR.</li>
	<li>ضع الأجنة في أطباق بتري معقمة مقاس 10 سم مع 0.1x MMR مع المضادات الحيوية لإزالة الهلام (البنسلين 100 وحدة /mL ، العقدتومايسين 100 ميكروغرام / ميكرولتر ، 0.25 ميكروغرام / مل ، جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل).</li>
	<li>تحت المجهر الفلوري، قم بإزالة معاطف الهلام وأغشية الفيتلين من أجنة GFP+ باستخدام ملقط حادة (أبعاد تلميح 0.05 × 0.01 مم2).</li>
	<li>نقل الأجنة GFP + إلى طبق بتري جديد. تقليل كمية السائل المنقولة من طبق بتري حيث كانت dejellied.</li>
	<li>شطف GFP + الأجنة المضيفة مع معقمة 0.1x MMR مع المضادات الحيوية أربع إلى ست مرات من أجل إزالة الملوثات.</li>
	<li>ضع الأجنة النظيفة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل التطعيم. ملاحظة: تبريد الأجنة يجعلها أكثر صلابة ونظيفة فصل mesoderm من endoderm ممكن.</li>
</ol>5. Haploid - diploid كيميرا جيل
<ol><li>الطبق الجراحي وإعداد وسائل الإعلام<ol>
<li>إعداد الأطباق الجراحية العقيمة التشغيل عن طريق صب autoclaved 2٪ أغاروز في 0.1x MMR في العقيمة 35 ملم سهلة قبضة بيتري الأطباق. ملء أطباق بيتري في منتصف الطريق مع agarose.</li>
		<li>بعد يبرد agarose، استخدم مشرط معقم لقطع حوض طويل بطول 25 مم مائل في الأغروز لعقد الأجنة في مكانها.</li>
		<li>ملء الطبق مع وسائل الإعلام الجراحية المعقمة (0.1x MMR مع مكافحة الميكوبلازما 2.5 ميكروغرام / مل، أمبوشوتريكسين B 0.25 ميكروغرام / مل، وسيبروفلوكساسين 10.0 ميكروغرام / مل) والتبريد في 4 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إجراء تطعيم الأجنة<ol>
<li>ضع متبرعًا صحيًا واحدًا مع واحد أو اثنين من الأجنة المضيفة GFP + diploid المتطابقة مع مرحلة داخل الحوض الصغير لطبق التشغيل السابق الذي يحتوي على وسائط جراحية(الشكل 3). ملاحظة: قم بإجراء الإجراء على مرحلة تبريد (10 درجة مئوية أو أقل) إذا كان ذلك ممكناً.</li>
		<li>استخدام اثنين من غرامة فائقة، ملقط الأوتوكلاف (طرف مستقيم، وأبعاد تلميح 0.05 × 0.02 ملم2)لإزالة طبقات ectoderm وmesoderm من المضيف مع برعم الطرف بالقرب من المركز(الشكل 4). ملاحظة: منطقة ترقيع الأنسجة المستطيلة تشمل برعم الأطراف وتمتد من السوميت التاسع إلى النصف الخلفي من انتفاخ الخيشوم، حوالي 2 ملم، على طول المحور الخلفي الأمامي. على طول المحور الظهري، تمتد المنطقة المطعمة حوالي 1.5 مم، بما في ذلك السوميتس إلى ما وراء الحافة البطنية لانتفاخ الخيشوم. وتشمل المنطقة المطعمة جميع الألواح الجانبية mesoderm والأنصاف الجانبية للsomites ، دون إزعاج البطانة الكامنة. راجع الشكل 4 والفيديو المصاحب للحصول على التفاصيل.</li>
		<li>وضع جانبا الأنسجة المضيفة وإزالة ورقة الأنسجة مكافئ الحجم من المانح haploid باستخدام نفس الطرق.</li>
		<li>ضع ورقة الأنسجة المانحة haploid على المنطقة المقابلة من الجنين المتبرع.</li>
		<li>قم بتأمين الأنسجة من خلال تغطيتها بشظايا زجاجية مستطيلة مستطيلة من زجاج غلاف مجهري مسحوق والضغط عليها بلطف في جسم الجنين المضيف.</li>
		<li>اقلب جنين المانح ة الهابلويد على جانبه الآخر لحصاد برعم الأطراف للجنين المضيف الثاني. كرر الخطوات 5.2.2 من خلال 5.2.5.</li>
		<li>قم بإزالة الأنسجة المضيفة الزائدة المتبقية بعناية والجنين المتبرع به من الطبق.</li>
		<li>اترك الطعوم مع مراسي شظايا الزجاج في مكانها لمدة 60-75 دقيقة، والتحقق من كل 20 دقيقة للتأكد من أن الزجاج لم ينزلق.</li>
		<li>بعد ترقيع الأنسجة تلتزم تماما، واستخدام ملقط لتقشير ببطء قبالة المراسي شظايا الزجاج.</li>
	</ol>
</li>
	<li>صيانة الكيميرا<ol>
<li>نقل الأجنة المطعمة إلى وسائل جراحية جديدة والحفاظ عليها في 8-12 درجة مئوية بين عشية وضحاها للشفاء. منزل الأجنة المطعمة بشكل فردي في 12 أو 24 لوحة بئر.</li>
		<li>بعد 36-48 ساعة، قم بنقل الأجنة المطعمة إلى مضادات المضادات الحيوية المعقمة 0.1x MMR. المضادات الحيوية القوية في وسائل الإعلام الجراحية تسبب سمية في الأجنة المطعمة بعد 3 أيام.</li>
		<li>استبدل الوسائط بـ 0.1x MMR طازجة ومضادات حيوية كل 2-3 أيام.</li>
		<li>الحفاظ على الأجنة المطعمة عند 18 درجة مئوية حتى تتمكن من تغذية28.</li>
		<li>بعد 1 إلى 2 أشهر من التطوير والرعاية ، يمكن تسجيل أطراف هابلويد لنقاء الكسب غير المشروع باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت. ملاحظة: إن وجود أنسجة GFP المشتقة من المضيف غير العصبي أو غير الدم في الأطراف هو مؤشر على التطعيم النجس وغالباً ما يرتبط بتطور الأطراف غير الطبيعي. وينبغي استبعاد هذه الحيوانات من مزيد من التحليل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li>
<li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li>
<li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li>
<li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li>
<li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate%3A+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li>
<li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Axolotl+Heads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li>
<li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li>
<li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
<li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352(2013).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li>
<li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I%3A+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li>
<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+%2832+Gb%29+Axolotl+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548(2018).</li>
<li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li>
<li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22%5BJournal%5D)">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li>
<li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li>
<li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li>
<li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Meets+Single%3A+The+Application+of%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR%2FCas9+in+Haploid+Embryonic+Stem+Cells.+Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
<li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Medicine%3A+Research+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+A+%22Salamanders+in+Regeneration+Research%3A+Methods+and+Protocols%22">Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl%2C+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li>
<li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+stages+of+development+of+the+axolotl%2C+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li>
<li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f.+Entwicklungsmechanik%22%5BJournal%5D)">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في بروتوكولنا لتوليد الكيميرا haploid-diploid أن فني التشغيل يجب أن تنظر في نتائج التطعيم متسقة.
السبب الأكثر احتمالاً لفشل جيل haploid يرجع إلى ظروف التنشيط السيئة في المختبر. يجب استخدام الكميات المناسبة من الحيوانات المنوية المتحركة لتنشيط البيض. لإطالة الحركة، يجب الحفاظ على عينات الحيوانات المنوية دائما عند 4 درجة مئوية. قبل تطبيق أي عينة من الحيوانات المنوية على البويضات، تحقق من صلاحية الحيوانات المنوية باستخدام مجهر مقلوب. لا ينبغي أبدا استخدام الحيوانا...

تاريخيا، كان تطعيم الأنسجة الجنينية في البرمائيات تقنية هامة لاستكشاف الآليات الأساسية لبيولوجيا النمو والتجدد. يمتلك الأكسولوتل، وهو نوع من السلمندر، قدرة مثيرة للإعجاب على تجديد الأنسجة والهياكل المعقدة مثل الأطراف والأعضاء بعد الإصابة أو البتر. وبالمثل، فإنها يمكن أن تتلقى، دون رفض، ترقيع الأنسجة من أفراد آخرين في مراحل الجنين، والأحداث، والكبار1،2،3. مناطق الأجنة التي تنتج هياكل كاملة مثل الأطراف والذيول والعينين والرؤوس ، والأنسجة الأكثر تحديدًا ، مثل neuroectoderm والسوميتس ، يمكن تطعيمها بين الأجنة لإنتاج الحيوانات الشيمية1،2،4،5،6. على مدى ما يقرب من قرن من الزمان ، قدمت دراسات مثل هذه الحيوانات الوهمية رؤى حاسمة في التجديد ، وتمايز الأنسجة ، والتحكم في الحجم ، ونمط1،7،8.
في العقد الماضي ، أنتجت العديد من الدراسات النسخة من الأنسجة التجدد رؤى في البرامج الوراثية الكامنة وراء تجديد السلمندر9،10،11،12،13. وقد أضافت هذه الدراسات إلى قائمة موسعة من الجينات المرشحة التي، حتى الآن، غير قابلة للتوصيف إلى حد كبير في سياق التجديد. تقنيات الطفرات المستهدفة ، مثل CRISPR / Cas ، تسمح الآن بالتحقيق في مثل هذه الجينات ، ويتم تسهيل هذه النهج الجينية إلى حد كبير من خلال التسلسل والتجميع الأخير لجينوم axolotl الكبير14،15،16.
سعينا لتطوير التقنيات التي قرنت البيولوجيا التنموية الكلاسيكية مع التكنولوجيا الوراثية الجديدة لغرض تشريح آليات التجديد. وقد وضعت أساليب لتوليد الأجنة haploid من axolotls وغيرها من السلمندر لعقود17. في حين أن هذه التقنيات قد لوحظ منذ فترة طويلة لتكون مزايا السلمندر ككائنات النموذج الجيني18، إلا أن الدراسات الجينية اللاحقة قليلة أدرجت الحيوانات الهابلويد. نحن نستخدم في تنشيط المختبر في axolotl لإنتاج الأجنة haploid التي تعمل كمتبرعين الأنسجة لتطعيم19. باستخدام الأجنة التي تحمل علامات وراثية فلورية ، ابتكرنا طرقًا موثوقة لتوليد الأطراف المشتقة بالكامل تقريبًا من أنسجة المتبرعين(الشكل 1A). من خلال الجمع بين هاتين التقنيتين ، تجاوزنا الفتك الجنيني المتأخر المرتبط بالهابلويد ، مما يسمح بإنتاج أطراف هابلويد مطورة تمامًا والمطعمة(الشكل 1B، الشكل 1B"، والشكل 2).
من خلال إجراء CRISPR / Cas بوساطة الطفرات في الأجنة haploid قبل التطعيم لإنشاء axolotls الوهمي مع أطرافها هابلويد متحولة ، قد نحقق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في سياق تطور الأطراف وتجديدها. وهذا يسمح بإنقاذ الأطراف من الأنماط الظاهرية المتحولة الجنينية المحتملة. في حين يمكن أن تولد CRISPR / Cas microinjection الحيوانات التي هي متحولة للغاية ، فإن هذه الحيوانات عادة ما تكون فسيفساء عالية ، مع درجة ما من الاحتفاظ بأليلات النمط البري ومجموعة متنوعة من الطفرات المتميزة في المواقع المستهدفة14،20. CRISPR القائم على الطفرات في خلايا haploid يزيد من penetrance واحد أليل فقدان وظيفة الطفرات، كما أنها لا يمكن أن تكون ملثمين من قبل alleles البرية المحتفظ بها. لهذا السبب ، يتم استخدام الفحص القائم على CRISPR في خطوط الخلايا haploid بشكل متزايد للتحقيق في الأساس الوراثي للعديد من العمليات الخلوية21،22،23. من خلال الجمع بين تتبع النسب CRISPR المستندة إلى بروتوكولات تطعيم برعم الأطراف haploid ، يمكن للنهج الموصوف هنا أن يكون بمثابة منصة للشاشات الوراثية haploid في الحيوانات الحية20.

<table><tbody><tr><td># 55 Dumont Fallps</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11295-1</td><td>استخدم فقط مادة Dumostar (يمكن تعقيمها)</td></tr> <tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td>20 مل</td></tr><tr><td>مضاد حيوي مضاد للفطريات 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td> <td>bioworld</td><td>40600032-3</td><td>Ficoll 400</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1914-250MG</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة التدفئة / التبريد</td><td>RevSci</td><td>RS-IF-233</td><td></td></tr><tr><td>موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية</td><td>Merk</td><td></td><td>Chorulon</td></tr><tr><td>Megascript T7 طقم النسخ</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 تفاعلا</td></tr><tr><td>Miroscope Cooling Stage</td><td>Brook Industries</td><td>مخصص</td><td>مخصص</td></tr><tr><td>NLS Cas9 بروتين</td><td>PNAbio</td><td>CP01-200</td><td>4 قوارير من 50 & ميكرو ؛ ز بروتين لكل</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt-1</td><td>مستوى العلاج</td></tr><tr><td><قوي>وصفات< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0x محلول مارك المعدل (MMR)</td><td></td><td></td> <td>0.1 م كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي ملي MgSO4 ، 2 ملي CaCl 2 ، 0.1 ملي EDTA ، 5 ملي هيبس (درجة الحموضة 7.8) ، الرقم الهيدروجيني 7.4</td></tr><tr><td>محلول هولتفريتر</td><td></td><td></td><td>40٪ 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.2 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.8 ملي مولار هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >3< / > ، 0.2 ملي كلوريد المكالسيوم < الفرعي >2< / > ، 4 ملي مولار MgSO4 ، الرقم الهيدروجيني إلى 7.4</td></tr></tbody></table>

جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

وهناك مجموعة متزايدة من التقنيات الوراثية والموارد تمكن الباحثين من استكشاف الأصول الجزيئية لقدرة بعض أنواع السلمندر، مثل الأكسولوت، على تجديد أطرافها بأكملها كبالغين. هنا ، نحدد التقنيات المستخدمة لتوليد الأكسولوتات الشيميرية مع الأطراف الأمامية haploid Cas9 المغيرة التي يمكن استخدامها لاستكشاف وظيفة الجينات ودقة تجديد الأطراف. نحن نجمع بين العديد من التقنيات الجنينية والجينية ، بما في ذلك توليد haploid عن طريق التنشيط في المختبر ، وCRISPR / Cas9 mutagenesis ، وتطعيم الأنسجة في بروتوكول واحد لإنتاج نظام فريد للفحص الوراثي haploid في كائن نموذجي للتجديد. تقلل هذه الاستراتيجية من عدد الحيوانات والمساحة والوقت اللازم للتحليل الوظيفي للجينات في تجديد الأطراف. وهذا يسمح أيضا بالتحقيق في وظائف تجديد محددة من الجينات التي قد تكون مطلوبة لعمليات أساسية أخرى، مثل تكوين الأعضاء، ومورفولوجيا الأنسجة، وغيرها من العمليات الجنينية الأساسية. الطريقة الموصوفة هنا هي منصة فريدة لإجراء الفحص الوراثي haploid في نظام نموذج الفقاريات.

يمكن تمييز الأجنة الهابلويد النامية من الأجنة الدوبلويد من خلال "متلازمة haploid" النمط الظاهري29. في مرحلة الكسب غير المشروع ، تعرض الأجنة الهابلويد انحناءً انحنٍ على طول المحور الأمامي الخلفي والضميمة غير المكتملة لقابس الصفار(الشكل 3A). يمكن استخدام المجهر الفلوري لضمان خلو الأجنة الهابلويدية من التعبير عن GFP المشتق من الناحية الأبوية(الشكل 3B).
<p class="jove_cont...

هذا الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج axolotls الوهمي مع الأطراف الأمامية haploid المستمدة من الأنسجة المانحة Cas9 المغيرة باستخدام تقنيات تطعيم الأنسجة الجنينية.

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

يسمح هذا البروتوكول بإنتاج أطراف هابلويد مُتَمَحَّة يمكن استخدامها في الفحص الجيني في الفأسولوتيل. في haploids، حتى الطفرات منخفضة المستوى يمكن أن تنتج فقدان الأنماط الظاهرية وظيفة داخل الخلايا. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية التطعيم لإنقاذ الأنماط الظاهرية القاتلة الجنينية.يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التجدد في أي نوع من البرمائيات التي هي قابلة للتخصيب في المختبر والتطعيم. قبل استخدام أجنة الهابلويد كمتبرعين، نوصي بممارسة وتأكيد نجاح الطعوم بين الأجنة الموجبة والسالبية من GFP. لإعداد الإناث المتبرعين، تخدير ناضجة جنسيا الأبيض أو الأبيض RFP الإناث axolotl لتكون بمثابة المانح gamete.بعد التأكد من عدم وجود استجابة لمحاكاة الألم ، استخدم حقنة الأنسولين 30 لقياس لحقن 0.15 ملليلتر من gonadotropin المشيمية البشرية في الظهر العضلي إلى الطرف الخلفي. أدخل الحقنة بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط لتجنب ملامسة الحبل الشوكي. وضع الحيوان المحقون في حل 40٪ Holtfreter الطازجة ونقل axolotl إلى ثلاجة درجة مئوية من ثمانية إلى 12 لمدة 48 ساعة.ثم ارجع الأنثى إلى درجة حرارة الغرفة. في حين أن الأنثى تضع البيض ، ضع ذكرًا مُهدّدًا بالكامل في موضع الوبيب على مناشف ورقية رطبة تحت مجهر تشريح ووضع طرف ماصة P1000 في قاعدة كلواكا مع اليد المهيمنة. ضع السبابة الأخرى والإبهام من اثنين إلى ثلاثة سنتيمترات من الجرندر إلى الحوض والضغط بلطف على الحيوان أثناء تحريك الأصابع نحو الساقين الخلفيتين لطرد عينات البول المنوية التي تجمع كل عينة في أنبوب جديد للريف الدقيق.ثم نقل خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى طبق بيتري لفحص نوعية الحيوانات المنوية باستخدام مجهر مقلوب. بعد العد، وتمييع الحيوانات المنوية إلى تركيز ثماني مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر في 0.1X MMR العقيمة ونقل 0.5 ميكرولترات من خلايا الحيوانات المنوية لكل بويضة إلى طبق بيتري جديد. ثم استخدم طرف الماصات لنشر التعليق إلى طبقة سميكة ملليمتر واحد واستخدام رفع البلاستيك لوضع عينة أربعة سنتيمترات من المصابيح من 254 نانومتر crosslinker للإشعاع في ثماني مرات 10 إلى الجزئيات الخامسة لكل ملليمتر مربع.بعد جمع عينة الحيوانات المنوية صحية، وضع الأنثى في موقف supine على كومة من المناشف الورقية الرطبة واستخدام حركة التنظيف مماثلة لاستخراج البيض غير المخصب من axolotl الإناث. ثم استخدام ملقط الرطب لنقل البيض في طبق بيتري 10 سم. في غضون 15 دقيقة من جمع، واستخدام ماصة P10 لصرف الحيوانات المنوية المشعة على البويضات غير المخصبة طلاء كل بيضة مع 0.25 إلى 0.5 ميكرولترات من الحيوانات المنوية المعطلة.بعد السماح للبيض بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، غمر البيض بـ 0.1X MMR. بعد ثلاثين دقيقة من الترطيب ، استخدم ملقطًا حادًا لتخريد البيض ووضع البيض عند درجة 18 درجة مئوية للانصاب الدقيق في غضون سبع ساعات. لتوليد chimera haploid-diploid، وضع متبرع واحد صحي haploid مع مرحلة واحدة أو اثنتين مطابقة GFP الأجنة المضيفة إيجابية diploid داخل الحوض الصغير لطبق التشغيل قبل المبردة التي تحتوي على المتوسطة الجراحية على 10 درجة مئوية أو أقل مرحلة التبريد.استخدام اثنين من autoclaved غرامة جدا ملقط تلميح مستقيم لإزالة برعم الأطراف بأكملها و ectoderm المحيطة طبقات الأنسجة وميسوديرم وتوضع جانبا الأنسجة المضيفة. إزالة اغدغ الأنسجة ذات الحجم المكافئ من المتبرع haploid ووضع هابلويد المانحة معجد الأنسجة على المنطقة المقابلة من الجنين المضيف. تأمين الأنسجة مع قطع الزجاج مستطيلة autoclaved من غطاء المجهر سحقت واضغط بلطف الأنسجة في الجسم الجنين المضيف.اترك المرساة في مكانها لمدة 60 إلى 75 دقيقة للتحقق من كل 20 دقيقة للتأكد من أن الزجاج لم ينزلق قبل استخدام ملقط لتقشير جزء الغطاء الزجاجي. نقل الأجنة المنقوشة إلى المتوسطة الجراحية الطازجة مما يسمح لهم بالشفاء في 8 إلى 12 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل إسكان الأجنة المنقوشة بشكل فردي في 12 أو 24 لوحة بئر. 38.7٪ من البويضات المتقدمة إلى الأجنة هابلويد وضعت عادة.في مرحلة الكسب غير المشروع ، تظهر أجنة haploid انحناءًا مخفضًا على طول المحور الأمامي الأمامي وضميمة غير مكتملة لسد الصفار. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المجهر الفلوري لتأكيد أجنة haploid خالية من تعبير GFP المستمدة من الأبوة. الطعوم الفاشلة والناجسة تنتج مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية.عندما تكون الطعوم نظيفة وعادة ما تكون متطورة، يجب أن يقتصر التعبير GFP في المقام الأول على الضفيرة العضدية، والشبكة العصبية المستمدة من الحبل الشوكي المضيف. التعبير عن GFP punctate موجود أيضا في الخلايا الفردية التي يبدو أن الخلايا العصبية الحسية في خلايا المضيفة المستمدة من الدم التي تهاجر إلى الطرف النامية. عندما يتم استخدام المتبرعين الإيجابيين RFP، تظهر أطراف الكسب غير المشروع الهابلويد تعبيرًا عالميًا عن RFP.طوال التنمية ، تكون أطراف haploid غير المُمَاجَنة أقصر بكثير من المُقَدَّمة diploid المتعارضة في الشيميك. تتجدد أطراف الدم الحميد غير المُؤجَّرة تمامًا ، على الرغم من أنها تظهر تأخيرًا طفيفًا في الوصول إلى مرحلة النمو الرقمي مقارنة بالدبلويدات. تذكر استخدام تقنية معقمة وإزالة تماما واستبدال كامل الطبقات الأنسجة ال ميديرم و ectoderm من المضيف الجنيني من أجل إنتاج طرف المطعمة نظيفة.يمكن بتر الأطراف المتحولة وحصدها للنمط الظاهري للتجدد. يمكن قياس آليل متحولة مع تسلسل الجيل القادم. جنبا إلى جنب مع كريسبر-Cas9 mutagenesis، وقد سمح لنا تقنية التطعيم لدينا لإجراء شاشة اختيار سلبية من الجينات المستهدفة في تجديد أطرافها haploid.

generation-chimeric-axolotls-with-mutant-haploid-limbs-through

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

دليل خطوة بخطوة لتوليد اجنة استهدفت الزرد خيالية بواسطة زرع في المرحلة الأريمة أو المعيدة.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

الزرد زرع الخلايا يمكن الجمع بين علم الوراثة وعلم الأجنة لتوليد نسيج الوهم محددة. هذا الفيديو يوضح المعيدة نظموا زرع الخلية التي سمحت مختبرنا للتحقيق في دور السكان astroglial والعظة توجيهات محددة خلال تشكيل الصوار في الدماغ المقدم.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

وتشارك أكثر بسبب المشيماء الثابت والأجنة لينة ، والتلاعب في الأجنة في الميداكا من الزرد. هذا الفيديو يظهر خطوة بخطوة إجراءات لكيفية التعامل مع الأجنة الميداكا ، بما في ذلك dechorionation ، agarose المتصاعد في التصوير وزرع الخلايا لانتاج الوهم. هذه الإجراءات ضرورية لاستخدام الميداكا والزرد في مختبر للاستفادة الكاملة من ميزات التكامل بينهما للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات.

Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

عن طريق تطعيم الخرز المنقوع في عوامل النمو أو مثبطات محددة لمسارات الإشارات إلى الأجنة النامية ، من الممكن اختبار آثارها مباشرة في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، يتم تطعيم الخرز في برعم الطرف لتحديد تأثيرات هذه الجزيئات على التعبير الجيني ونقل الإشارة.

مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني

الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1 و. ويتجلى هنا، خطوة الزرع.

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

نقدم هنا البروتوكولات تخطيط صدى القلب للحصول على الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لقلب ينبض من السمندر أكسولوتل (ميكسيكانوم أمبيستوما)، أنواع نموذجية في إنعاش القلب. تسمح هذه الأساليب لتقييم وظيفة القلب بدقة عالية الزمانية المكانية الطولية.

تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد في أكسولوتل (ميكسيكانوم أمبيستوما)

يقدم هنا بروتوكول لتنفيذ الوقت والفضاء مقيدة الجينات ضرب الخروج في الحبال الشوكي ة عن طريق حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية الحبل الشوكي تليها الكهربائي.

الجينات المباشرة ضرب من Axolotl الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية عن طريق الكهربائي من المجمعات CAS9 البروتين-gRNA

توضح هذه المقالة كيفية إجراء طريقة جراحية لمنع تكوين بشرة الجرح أثناء تجديد الأطراف axolotl عن طريق خياطة الجلد كامل السماكة على الفور فوق مستوى البتر. تسمح هذه الطريقة للباحثين بالتحقيق في الأدوار الوظيفية لبشرة الجرح خلال المراحل المبكرة من تجديد الأطراف.

تثبيط تكوين بشرة الجرح عن طريق جراحة سديلة الجلد الكاملة أثناء تجديد الأطراف Axolotl

الأطراف المؤتلفة هي نموذج تجريبي قوي يسمح بدراسة عملية تمايز الخلايا وتوليد الأنماط تحت تأثير الإشارات الجنينية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد أطراف مؤتلفة مع خلايا الجلد المتوسط لأطراف الدجاج ، قابلة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى التي تم الحصول عليها من كائنات حية مختلفة.

فحص الأطراف المؤتلفة للدجاج لفهم التشكل والتنميط والخطوات المبكرة في تمايز الخلايا

يتم تقديم بروتوكول لجراحة قطع عظم الفخذ مع استخدام تثبيت اللوحة الداخلية في قنافذ البحر الناضجة. يمكن استخدام الإجراء لإجراء دراسات مقارنة حول تجديد الأطراف والتئام الكسور في البرمائيات المائية.

تثبيت قطع عظم الفخذ مع تثبيت الصفائح في Ambystoma mexicanum

في هذا البروتوكول ، نوضح كيفية تحضير أنسجة قنافذ البحر للفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) وإجراء قياسات المسافة البادئة في غضروف الأطراف السليم والمتجدد.

قياسات مجهر القوة الذرية للغضروف في أطراف قنافذ البحر السليمة والمتجددة

تعلم تقنية التطعيم الجنيني لإنتاج أطراف هابلويد متحولة في الأناكسولوت لدراسة التجدد والفحص الوراثي. تتيح هذه الطريقة للباحثين استكشاف آليات الجينات في البرمائيات.

جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني

استكشف المزيد من الفيديوهات