تحليل وظيفة الخلية الفضائية أثناء تجديد العضلات الهيكلية عن طريق إصابة السموم القلبية وحقن siRNA ذاتية التسليم في فيفو

هذه التقنية تسمح مزيج من الحقن العضلي من الثعابين سم القلب، والحقن العضلي من سيرنا الذاتي التسليم، مما يسمح بتحليل تجديد العضلات الهيكل العظمي. تطبيق سيف الذاتي سيرنا هو وسيلة أنيقة للتحقيق في فقدان وظيفية للجينات واحدة أثناء تجديد العضلات، وبالتالي تجنب الحيوانات المعدلة وراثيا. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم، حلق منطقة الحقن في الساق السفلى من الركبة إلى الكف، وإزالة أي شعر فضفاض.

ضع الماوس في حالة الوبين على لوحة العنوان المغطاة بقطعة قماش جراحية معقمة ، واستخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير منطقة الحقن في أسفل الساق القحفية. بعد ذلك، قم بتحميل حقنة الأنسولين المجهزة بإبرة من عيار 29، مع 50 ميكرولترات من 20 من مضادات أمراض القلب الدقيقة وثقب الجلد بالكامل في العضلات، مجرد ثني إلى الركبة. عندما الإبرة في مكان, حقن 10-20 ثانية تسليم فترة 10-20 ثانية على طول العضلات, أثناء تحريك الإبرة ذهابا وإيابا, للسماح بتوزيع بالتساوي من cardiotoxin, وبالتالي إصابة كامل عضلة العينية الأمامية.

ثم العودة إلى قفص الماوس على وسادة التدفئة مع مراقبة حتى املء. بعد ثلاثة أيام من الجراحة، قم بتطهير منطقة الحقن كما هو موضح للتو. حقن ما يصل إلى 50 ميكرولترات من سيرنا موجهة ضد الجين المستهدف من الفائدة في العضلات الأمامية tibialis من الفأر تخدير، كما أظهرت للتو.

ثم ارجع الفأر إلى قفصه ، مع المراقبة حتى إعادة شغل كامل. قبل جمع الأنسجة العضلية المصابة، التفاف احباط حول قلم رصاص وختم قلم رصاص مع الشريط، بحيث الجزء السفلي من القالب يوفر سطح حتى، مغلقة. عندما يكون القالب جاهزًا ، يطهر الحيوان بأكمله بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستخدم مقصًا حادًا إضافيًا لإزالة الجلد في الكاحل.

قبل حصاد العضلات، استخدم ملقطًا ناعمًا لقرصة ملقط مغلقة من خلال اللفافة بجوار عظم الساق في كاحل الساق المصابة، وتحريك ملقط نحو الركبة لتمزيق اللفافة، مما يعرض العضلة الأمامية الصدبية. لعزل العضلات الأمامية tibialis، وفضح وتر القعر، والاستيلاء على وتر مع ملقط غرامة. استخدام مقص الربيع لقطع وتر, واستيعاب العضلات في وتر لسحب العضلات نحو الركبة.

للسماح لتحليل منطقة منتصف البطن، واستخدام مقص مستقيم لقطع العضلات الأمامية tibialis في منطقة منتصف البطن إلى نصفين من الحجم المتساوي، وملء قالب قلم رصاص في منتصف الطريق مع تجميد الحل. إدراج نصفي العضلات الأمامية tibialis في القالب تجميد في وضع تستقيم، مع منطقة منتصف البطن التي تواجه الجزء السفلي من القالب. استخدام ملقط لنقل العفن تجميد في منتصف الطريق إلى النيتروجين السائل.

عندما يتغير متوسط التجميد من شفاف إلى أبيض ويصبح صلبًا، قم بنقل القالب المتجمد إلى ثلاجة درجة 80 مئوية، أو إلى جليد جاف للمعالجة المستقبلية. في عضلات التحكم ، تظل بنية الأنسجة سليمة ، كما لوحظ من خلال توطين النوى في محيط الميوفيبير ، وعدم تراكم الخلايا أحادية النويات داخل الفضاء الخلالي. بعد سبعة أيام من الإصابة بوساطة cardiotoxin ، يتم تشكيل myofibers الجديدة كما تميزت نوات ذات موقع مركزي ، وتراكم الخلايا أحادية النواة التي تتكون في الغالب من خلايا الأقمار الصناعية ، ولكن أيضا الخلايا غير العضلية مثل الخلايا المناعية.

تحت ظروف الراحة، تقع خلايا الأقمار الصناعية كما تم تمييزها بـ Pax7 تلطيخ باللون الأحمر، تحت lamina القاعدية، تظهر باللون الأخضر هنا. بعد ثلاثة أيام من الإصابة، يزداد عدد الخلايا الساتلية، ولم تعد الخلايا التابعة موجودة تحت الصفيحة القاعدية. في اليوم 10 بعد الإصابة، لا يزال عدد الأقمار الصناعية زيادة.

لمزيد من تحليل عملية التجديد ، يمكن أن تكون موبيبيريس المشكلة حديثا ملطخة بالأجسام المضادة الموجهة ضد myosin التنموية. بعد يومين من الحقن مع سيرنا، يمكن تحليل الخلايا الفضائية لوجود سيرنا المسمى الفلورسنت. في هذه التجربة التمثيلية، حوالي 75٪ من الخلايا الساتلية في العضلات المتجددة كانت إيجابية لsRNA المسمى الفلورسنت.

وعلاوة على ذلك ، حوالي 74 ٪ من جميع myofibers تجديد كانت إيجابية أيضا لsrna المسماة فلورية ، مما يشير إلى أن 74 ٪ من myofibers تجديد استغرق siRNA ، أن خلايا الأقمار الصناعية إيجابية سيرنا قد انصهرت معا لتشكيل myofibers جديدة ، أو أن الانصهار مع myofibers تجديد القائمة بالفعل قد وقعت. الخطوة الأكثر أهمية هي تحقيق إصابة كاملة في العضلة الأمامية. بالإضافة إلى التحليل النسيجي، يمكن تسجيل معلمات مثل القوة المولدة لتحليل تجديد العضلات الهيكلية بطريقة وظيفية.