تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

يمكن استخدام هذه الطريقة لتسهيل التصور من العمليات الفلكية غرامة جدا لتقييم التفاعلات العصبية الفلكية في المشبك أثناء المرض والدول ثابتة. يمكن تطبيق هذه التقنية أيضا في أي نموذج الماوس أو مجموعة الخلايا أو منطقة الدماغ. لإعداد قطب حاد مع مقاومة مناسبة، سحب قطب واحد للبرميل زجاج البورسليكات مع خيوط على سحب ميكرويبيت.

تخزين الأقطاب الكهربائية المسحوبة في حاوية مغلقة لمنع الغبار من دخول النصائح والحفاظ على الأقطاب مرتفعة من أسفل المربع لمنع النصائح من كسر. لملء قطب كهربائي مع محلول صبغ أصفر لوسيفر، وضع القطب في موقف عمودي مع الحافة التي تواجه الهبوط، والماصات واحد إلى اثنين من ميكرولترات من محلول أصفر لوسيفر في الجزء الخلفي من القطب. انتظر من خمس إلى عشر دقائق حتى ينتقل المحلّل إلى الطرف عبر عمل الشعيرات الدموية قبل تأمين القطب المليء برفق في حامل قطب كهربائي متصل بجهاز مناور مع السلك الفضي لمالك القطب الكهربائي المتلامس مع الأصفر المُلِك داخل القطب.

لاختبار طرد الصبغة، ضع بلطف شريحة الدماغ ثابتة طفيفة في طبق أسفل الزجاج مليئة 0.1 PBS الضرس في درجة حرارة الغرفة وعقد شريحة في مكان مع القيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون. قم بتوصيل القطب الكهربائي بمصدر جهد كهربائي ووضع القطب الأرضي في الحمام الذي يحتوي على شريحة الدماغ. نقل الهدف من المجهر confocal إلى منطقة الدماغ من الفائدة وخفض القطب في الحل باستخدام عدسة غمر الماء 10X، ونقل القطب إلى مركز مجال الرؤية.

تحت الإضاءة في الميدان الساطع، قم بفحص القطب الكهربائي بعناية باستخدام عدسة غمر الماء 40X لضمان أن القطب يبدو واضحًا وبدون حطام أو فقاعات. قم بالتبديل إلى التصوير المجهري بالليزر confocal باستخدام ليزر 488 نانومتر. بدوره على محفز في 12 فولت لاختبار طرد صبغة.

وينبغي أن تكون سحابة صبغة الفلورسنت الكبيرة مرئية حول طرف القطب. ثم، تحت حقل مشرق انخفاض ببطء القطب نحو شريحة، ووقف فقط فوق السطح. لملء استروسيتي من الفائدة مع أيونتوبهورسيس، استخدم التداخل التفاضلي الأشعة تحت الحمراء النقيض لتحديد astrocytes مع سوماتا بيضاوية ممدود الشكل حوالي 10 ميكرومتر في القطر، 40 إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة.

هذا هو شعاع الطبقة من قرن آمون مباشرة تحت طبقة الخلية الهرمية. ونحن نتحرك من خلال الأنسجة، يمكننا أن نرى الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، الخلايا الفلكية، وأنواع الخلايا الأخرى. بمجرد اختيار استروسيتيت، قم بتحريك الخلية إلى مركز مجال الرؤية وخف ببطء طرف القطب الكهربائي إلى الشريحة، وانتقل عبر الأنسجة حتى يصبح القطب على نفس هيئة الخلية.

مرة واحدة في الجسم الخلية من astrocyte مرئيا بوضوح والمبينة، ببطء وبلطف تقدم القطب إلى الأمام، وتحريك القطب حتى تلميح impales سوما من الخلية. نقل التركيز من الهدف ببطء صعودا وهبوطا إلى ملاحظة إذا كان القطب الكهربائي داخل سوما. بمجرد أن يكون طرف القطب داخل الخلية، قم بتشغيل المحفّز عند 0.5 إلى فولت واحد لإخراج التيار باستمرار إلى الخلية.

باستخدام المجهر confocal، ومشاهدة فيلم الخلية، وزيادة التكبير الرقمي لتصور تفاصيل الخلية والتأكد من أن غيض من القطب مرئية داخل الخلية عند الضرورة. انتظر حوالي 15 دقيقة حتى تظهر الفروع والعمليات الدقيقة معرفة قبل إيقاف الجهد الكهربائي وسحب طرف القطب الكهربائي بلطف من الخلية. لصورة الخلية المعبأة، انتظر 15 إلى 20 دقيقة حتى تعود الخلية إلى شكلها الأصلي قبل ضبط الإعداد على المجهر confocal للتأكد من أن الفروع والعمليات الدقيقة تظهر محددة تحت الهدف 40X.

قم بإعداد مكدس Z بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر، وتحريك الهدف أثناء التصوير حتى لا تكون هناك إشارة من الخلية وتعيين تلك الخطوة على أنها الأعلى. ثم نقل الهدف إلى أسفل، مع التركيز من خلال الخلية حتى لا يكون هناك إشارة وتعيين تلك الخطوة كما في أسفل. بعد اكتمال التصوير، تحقق من القطب الكهربائي للبحث عن طرد الصبغة.

إذا ظهرت سحابة صبغ كبيرة، يمكن استخدام القطب للشريحة التالية. خلاف ذلك، استبدال القطب. من خلال توليد إسقاط كثافة القصوى ، يمكن ملاحظة عرض مفصل لبنية الفلكية في مجالها.

وهناك أربعة X حجم التكبير في الفلكية يكشف عن إسقاط كثافة القصوى من فرع رئيسي واحد، والعديد من الفروع الثانوية، وتوزيع الفروع المحيطة والنشرات. هنا، يتم عرض الصورة الأصلية لـ CA1 astrocyte. يتم إعادة بناء جسم الخلية والفروع الرئيسية والعمليات وحجم الأراضي المحاطة بـ astrocyte في هذه الصور اللاحقة.

بعد إنشاء عمليات إعادة الإعمار، تم تحديد كميات من سوما، الخلية بأكملها، والأراضي. وعدد الفروع الرئيسية تم عدّه. كما يتم التعبير عن البروتين الخلوي الهيكلي أن التسميات خيوط الفلكية المتوسطة في soma الخلية، والفروع الرئيسية، وبعض فروع استروسيات الثانوية، ولكن ليس في الفروع والعمليات الدقيقة.

في هذا التحليل التمثيلي، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في عدد الفروع الأولية التي تحمل اسم البروتين حمضي الرجفاني الدغلي وتلك التي تصور بواسطة الأصفر لوسيفر. وعلاوة على ذلك، كانت منطقة الخلية وحجم استروسايت المسمى بالبروتين حمضي الرجيلي الدليليس أصغر بكثير من المنطقة والحجم المرئي مع الأصفر لوسيفر، مما يدل على أن البروتين حمضي الرجلين الدبقية هو علامة موثوق بها لوضع العلامات على الفروع الرئيسية ولكن ليست مفيدة لتحديد المنطقة الكلية أو حجم الخلية. كمية الصبغة التي تم إطلاقها من طرف القطب يعتمد على مقاومة القطب الذي يجب أن يكون عاليًا بما يكفي للسماح بتدفق ثابت من الصبغة ليتم إخراجه.

يمكن للدراسات المستقبلية دراسة المكونات المختلفة للبنية الفلكية عن طريق المجهر الخفيف فائق الدقة أو التحليل المناعي لبروتينات محددة داخل بنية الأستروسيات.