التصوير بالخلايا الحية لتقييم ديناميات توقيت الطور ومصير الخلية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك

يتيح التصوير المباشر للخلايا مراقبة العمليات الخلوية الديناميكية بمرور الوقت داخل خلية واحدة. هذه النهج هي قوية لتقييم الظروف التي تؤثر على العملية الديناميكية لتقسيم الخلايا والكشف عن الآثار التي العيوب في الانقسام على انتشار الخلية ابنة والقدرة على البقاء. وتمثل السمية الضوئية التي تنتج عن التعرض للضوء أثناء التصوير تحدياً كبيراً يرتبط بهذا البروتوكول.

لذلك، يجب تحسين أوقات التعرض وفترة التصوير ومدتها. باستخدام تقنية معقمة ومستوى السلامة الحيوية اثنين مجلس الوزراء السلامة، واستخدام ماصة الزجاج المتاح العقيمة لpirate المتوسطة من لوحة الثقافة التي تحتوي على خط الخلية تحمل بناء التعبير من الفائدة. غسل الخلايا لفترة وجيزة مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقمة مع دوامة وعلاج الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.05٪التربسين.

بعد دقيقتين إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية، إضافة ثمانية ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى لوحة لوقف رد الفعل وإعادة تثبيت الخلايا المنفصلة مع الأنابيب لطيف. نقل حل الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر العقيمة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية الخلايا مرة أخرى.

resuspend بيليه في 10 ملليلتر من المتوسطة لحساب وتمييع الخلايا إلى واحد إلى اثنين مرات 10 إلى الخلايا 5 لكل ملليلتر من تركيز متوسط ثقافة الخلية. ثم بذور 500 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من لوحة 12-جيدا التصوير القاعي معقمة ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية للسماح للخلايا للتمسك سطح لوحة. قبل التصوير بما لا يزيد عن 30 دقيقة، أضف تركيزًا ذي صلة من دواء ميتور إلى بئر أو أكثر، ثم أضف حجمًا متساويًا من اللوين المانع إلى نفس عدد الآبار مثل الضوابط.

لإعداد المجهر للتصوير، ضع اللوحة على خشبة مسرح مجهر إبفلوروسانس مقلوب مجهز بكاميرا عالية الدقة، وغرفة بيئية محمّاة مسبقاً إلى 37 درجة مئوية، ونظام توصيل لثاني أكسيد الكربون المرطب 5٪. حدد هدف هواء 20 مرة بفتحة رقمية 0.5 ومجهزة لتباين الفلورس وتباين المرحلة عالي التباين، أو تصوير المجال الساطع وعرض الخلايا لضبط الدورة التدريبية والعثور على التركيز على الخلايا للتركيز. لتعيين أوقات التعرض الأمثل للحقل الساطع، و GFP، و RFP الحصول على الصور، حدد مكعبات التصفية ذات الصلة مع الإثارة المناسبة والانبعاثات للفلوروفوريس التي سيتم تصويرها وانقر فوق تشغيل.

إذا لم تكن الإشارة مكثفة بما فيه الكفاية، فقم بضبط التعريض التلقائي وفي كل قناة من قنوات الفلوروفور، حدد binning المناسب من القائمة المنسدلة Format. حدد ومعايرة مرحلة المجهر إلى طبق متعدد الآبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدام برنامج الحصول على الصور لتسليط الضوء على أو اختيار الآبار التي سيتم تصويرها. افتح لوحة التحكم في النقاط التي تم إنشاؤها وتحت منطقة العمل حدد مقيد والحدود لتقييد منطقة تحديد الإحداثيات لاستبعاد حدود البئر.

في القائمة المنسدلة تقييد المنطقة، حدد منطقة كاملة وحدد موضع نقطة عشوائي. تعيين العدد إلى ستة وانقر على Randomize لتحديد عدد وتوزيع النقاط التي سيتم التقاطها في البئر، على التوالي. ثم انقر فوق وأدخل القيم في لوحة التحكم تسلسل الوقت لتحديد وإدخال الفاصل الزمني والمدة لجمع الصور.

لتصور RFP-H2B المسمى كروماتين، حدد الصور التي تم التقاطها مع مكعب مرشح RFP في مكانها وتحديد خلية تدخل الانقسام كما هو مبين في ضغط الكروماتين الأولي وانهيار المغلف النووي لتحديد التوقيت الميتوتيك لمحاذاة الphase والphase في الخلايا الفردية. تتبع الخلية من الفائدة من خلال نقاط الوقت المتتالية في الفيلم المكتسبة لتحديد عدد من النقاط الزمنية أو دقائق من دخول ميتوليت حتى RFP-H2B المسمى الكروماتين يكمل المحاذاة عند خط الاستواء الخلية أثناء metaphase. لرصد توقيت ميتوتيك، والإخلاص الميتوليتية، ومصير الخلية، مواصلة تتبع الخلية من خلال نقاط زمنية متتالية لتحديد الوقت الذي فصل الكروموسومات anaphase واضح و / أو عندما يحدث إزالة التكقاق الصبغي وإعادة تشكيل المغلف النووي.

ثم تصور RFP-H2B لتحديد الخلايا في كل مجموعة من السكان التي تظهر عيوب ميتو المتعددة، بما في ذلك الكروموسومات المتخلفة وجسور الكروماتين أثناء فصل الكروموسومات الأنافاس. عن طريق تصور ألفا tubulin-EGFP، يمكن ملاحظة أن الخلايا التي تعاني من اضطراب المغزل تمر تغييرات ديناميكية كما يتم تحقيق تركيز سحب المغزل ويتم تشكيل مغزل ثنائي القطب في التحضير لتقسيم الخلية. وبالتزامن مع تجميع المغزل، يمكن تصور حركة الكروموسوم مع RFP-H2B لتقييم محاذاة الكروموسومات والإخلاص الفصلي.

باستخدام نهج التصوير الخلية الحية، تظهر هذه النتائج التمثيلية أن الخلايا ذات المحتوى المركزي العادي قادرة على الانطلاق من انهيار المغلف النووي من خلال محاذاة الphase وبداية الطور السفلي لتحقيق انقسام ثنائي القطب في أقل من 30 دقيقة. في وجود أقطاب إضافية، ما يقرب من 50٪ من الخلايا قادرة على التغلب على مغزل متعدد الأقطاب العابرة وتشكيل مغزل ثنائي القطب في انقسام الخلية كاملة. الخلايا المتبقية غير قادرة على تحقيق مغزل ثنائي القطب ونتيجة لذلك، الخروج من الانقسام من خلال تقسيم متعدد الأقطاب.

بغض النظر عما إذا تم تحقيق ثنائي القطب المغزل, الخلايا مع أقطاب إضافية يحمل زيادة كبيرة في مدة الانقسام مقارنة مع الخلايا مع اثنين من centrosomes. يشير إلى أن ديناميات تطور ميتوستيك قد تتغير حتى عندما لا تكون التغيرات في النتائج الميتاوتية واضحة. عند تحديد أوقات التعرض للقنوات الفلورية، قم بتحسين أوقات التعرض للحد من السمية الضوئية.

كما يمكن تحديد البكسل الكاميرا binning للسماح انخفاض مرات التعرض لاستخدامها. هذا الإجراء له تطبيقات في الفحوصات الدوائية، الغزو، وتحليل الهجرة. ويمكن أيضا استخدام هذه النهج لدراسة فعالية العلاج بالعقاقير أو ديناميات الحركة الخلوية.