اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار
نوفمبر 6, 2019
تقدم هذه المقالة طريقه تعديل سطح القوقعة التي تتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه للالتزام قطع من ظهاره قوقعة الراس إلى 10 مم زلة غطاء الجولة لمناعي في قوقعة الماوس الكبار.
الاستعدادات سطح القوقعة تسمح التصور للعدسة بأكملها من الجهاز من الكورتي باستخدام الكيمياء المناعية والتصوير confocal. وقد استخدمت على نطاق واسع للتحقيق في أمراض قوقعة معينة من الفائدة. سنقوم بتعديل طريقة microdissection القوقعة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الالتزام بقطعة من ظهارة قوقعة 10 ملليمترات مستديرة لـ 10 ملليمترات من أجل إجراء التميّز المناعي مع تجنب فقدان الأنسجة أثناء خطوات الغسيل المتعددة. بالإضافة إلى أمراض القوقعة ، يمكن أيضًا استخدام إعداد سطح القوقعة للتعبير التقييمي وتجديد خلايا الشعر. مطلوب مهارات المجهر الأساسية لهذه التقنية ، ويمكن أن تساعد على إظهار البصرية للأسلوب لضمان أن يتم تنفيذ كل خطوة بشكل صحيح.
إثبات الإجراء سيكون تشياوجون فانغ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لاستخراج العظام الصدغية، على الفور بعد الوفاة سحب الجلد في وقت ما للكشف عن عظم الجمجمة واستخدام مقص لقطع العظام من الجانب الخلفي إلى الأمام على طول خط وسط الجمجمة. استخدم ملقط لإزالة أنسجة المخ قبل استخدام الإبهام وإصبع السبابة لإزالة العظام الصدغية يدويًا من الفئران التي يبلغ عمرها ثلاثة أشهر أو أكثر.
ضع العظام في طبق بيتري قطره 30 ملليمترًا يحتوي على الثلج البارد الطازج بنسبة 4٪ PFA و PBS تحت مجهر تشريح وإزالة الستابس من النافذة البيضاوية. ثقب غشاء النافذة المستديرة مع عدد خمسة ملقط واستخدام إبرة قياس 27 تعلق على حقنة ملليلتر واحدة تحتوي على 4٪ PFA جديدة لجعل ثقب صغير في قمة القوقعة. بلطف وببطء افسد القوقعة بحل تثبيتي عبر النوافذ المستديرة والبيضاوية حتى يغسل المحلل من الثقب الصغير عند القمة.
ثم نقل ما يصل إلى اثنين من قوقعة الأذن إلى قنينات تلة 20 ملليلتر فردية تحتوي على 10 ملليلترات من 4٪ PFA لكل قارورة وتهيج العينات بلطف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، تليها التخزين بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على دوار. في صباح اليوم التالي، اغسل القوقعة بثلاث يغسل لمدة خمس دقائق مع PBS الطازجة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، إضافة 20 ملليلتر من 4٪ EDTA لكل قارورة وتدوير العينات لمدة 48 ساعة في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.
في نهاية الحضانة ، المس الجزء الدهليزي العظمي لكل قوقعة مع ملقط لتقييم مرونة العينات. إذا كانت العظام مرنة بدلا من شركة، وقد تم decalcified القوقعة. استبدل EDTA لكل عينة بـ PBS جديد.
بالنسبة للميكروفيسكشن للظهارة القوقعة، فهم الجزء الدهليزي من العظم الصدغي مع ملقط واستخدام مشرط لخفض بدوره apical في زاوية 45 درجة. قطع عموديا على طول الخط الخافت بين النافذة المستديرة والنافذة البيضاوية لفصل القوقعة من الجزء الدهليزي وتوجيه جزء القوقعة مع بدوره القاعي نحو أسفل ووسط يتحول نحو الجزء العلوي من طبق بيتري. من هذا الموقف، وقطع الكبسولة العظمية والجدار الجانبي من منتصف بدوره نحو النهاية التي تمت إزالة القسم apical ومواصلة القطع لفصل تماما الجزء الأوسط من المناطق القاعدية وخطاف.
وضع الجزء القاعدي والخطاف مع موقع غشاء basilar الموجهة نحو الجزء السفلي من الطبق، وقطع عموديا من medialis من منطقة هوك لإزالة الوسيطات وقطع المناطق القاعدية وربط لفصل جزء هوك. لتجنب تشويه الأنسجة ، وقطع الوسيطات قبالة منطقة هوك قبل الفصل من منعطف القاعدي ومنطقة هوك. قطع بعيدا أجزاء كبيرة نسبيا من كبسولة عظمية والأنسجة الجدار الجانبي من منتصف بدوره وعقد الجدار الجانبي مع ملقط لمحاذاة كبسولة عظمية والجدار الجانبي مع الجزء السفلي من طبق بيتري، وقطع هذه الأنسجة من جانب غشاء باسيلار.
المقبل، تسطيح العينة لتوجيه الجانب الجانب خلية الشعر الحسية سطح لأعلى وتقليم بعيدا بقية كبسولة عظمية والجدار الجانبي. ثم استخدام ملقط لإزالة غشاء tectorial لفصل تماما في المنطقة الوسطى وإزالة كبسولة عظمية، نسيج الجدار الجانبي، والمناطق tectorial من المنعطفات المتبقية كما أظهرت للتو. عندما تم تشريح جميع المنعطفات القوقعة ، انتشار 0.5 ميكرولترات من الخلايا والأنسجة لاصقة على مركز جولة واحدة 10 ملليمتر يغطي والسماح لللصق لتجف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ضع الأغطية المجففة في طبق بيتري والصق جميع القطع الأربع لكل عينة ظهارة حسية على غطاء واحد. ثم استخدام ملقط لفهم حافة واحدة من كل غطاء لنقل العينات إلى آبار فردية من طبق ثقافة الخلايا أربع جيدا للمناعة. بالنسبة للمناعة من الاستعدادات المشبكة للسطح، اغسل كل ظهارة حسية ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسيل، يليها علاج كل عينة بمليلترين من 2٪ من السطح غير الأيونيك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار.
في نهاية الحضانة، pirate حل السطحي من كل بئر ومنع أي ربط غير محددة مع 100 ميكرولترات من محلول حجب في بئر لمدة ساعة واحدة على الدوار مع التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح تحت التحريض لطيف قبل وضع علامة على كل ظهارة مع 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء. في اليوم التالي، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد والتحريض لطيف في غسل وتسمية العينات مع 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة من الفائدة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ثلاثة يغسل لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل قبل وضع كل غطاء على الشرائح المجهر الزجاجي الفردية مع العينات التي تواجه ما يصل. المقبل، إضافة بعناية ثمانية ميكرولترات من المتوسطة المناسبة تصاعد في وسط كل غطاء واستخدام ملقط لتركيب آخر 10 ملليمتر coverslip على كل عينة. ثم ختم الجانبين من كل شطيرة غطاء مع طلاء الأظافر واضحة، ووضع العينات في مجلد شريحة من الورق المقوى، وتخزين الشرائح في أربع درجات مئوية.
على الرغم من أن تشريح قوقعة الأذن الماوس الكبار للتحضيرات السطحية ليست بسيطة ، وينبغي أن يكون الباحثون الجدد لهذه التقنية قادرين على تعلم الطريقة بعد ممارسة مع 10 إلى 15 آذان. يبين تحديد المناعة للمستحضرات السطحية لفئران CBAJ غير المعالجة من 10 إلى 12 أسبوعًا مع CTBP2 وGluA2 أن كلاً من شرائط presynaptic والمحطات الطرفية بعد المينابتيكية على التوالي تقع تحت نواة خلايا الشعر الداخلية ويتم تجاورها مما يشير إلى نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. كشف التميّز المناعي لميوسين 7A ومواجهة الحساسية مع phalloidin وDAPI عن وجود خلايا شعر حسية بما في ذلك خلايا الشعر الخارجية وخلايا الشعر الداخلية والنوى الخاصة بها.
لا يظهر علم المناعة لميوسين 7A ومضادة مع phalloidin أي اختلافات في النشاط المناعي أو التوحيد مع أو بدون استخدام الخلايا والأنسجة لاصقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المسح المجهري للإلكترون من الاستعدادات السطحية من ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر C57 الأسود 6 الفئران تظهر جيدة التنظيم على شكل V stereocilia من خلايا الشعر الخارجي في ثلاثة صفوف من العينة. تذكر أن تملأ القوقعة بمحلول تثبيتي بلطف وببطء من خلال النوافذ المستديرة والبيضاوية حتى يغسل الحل من الحفرة الصغيرة عند القمة.
قبل فصل منطقة هوك من منعطف القاعدية، والحرص على قطع ميدياليس قبالة منطقة هوك لتسهيل إزالة medialis.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تُقدم هذه المقالة تقنية معدلة لتحضير سطح القوقعة تعتمد على إزالة الكالسيوم واستخدام لاصق للخلايا والأنسجة من أجل الكيمياء النسيجية المناعية في قوقعة الفئران البالغة. تعمل هذه الطريقة على تحسين رؤية عضو كورتي، بهدف تسهيل استقصاء أمراض القوقعة وتجدد الخلايا الشعرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأنسجة
خلفية علمية
- تتيح تحضيرات سطح القوقعة التصوير الكامل لعضو كورتي.
- تعد هذه التقنية ضرورية لفحص أمراض القوقعة.
- يهدف هذا التعديل إلى تقليل فقدان الأنسجة أثناء عملية الوسم المناعي.
- يعزز فهم هذه التحضيرات الدراسات المتعلقة بتعبير الخلايا الشعرية وتجددها.
الغرض من الدراسة
- تقديم منهجية منقحة لتجهيز سطح القوقعة.
- تحسين التصاق مقاطع القوقعة بشرائح التغطية.
- تقييم إمكانية فحص مختلف حالات وعلاجات القوقعة.
الطرق المستخدمة
- تتمثل المنصة الرئيسية المستخدمة في طريقة تحضير القوقعة خارج الجسم (ex vivo).
- يتضمن النموذج البيولوجي قوقعات فئران بالغة، والتي يتم معالجتها بعد الوفاة.
- تشمل الخطوات إزالة التكلس باستخدام EDTA والتشريح المجهري الدقيق لمناطق القوقعة.
- يتم تثبيت قطع القوقعة على شرائح تغطية باستخدام مادة لاصقة محددة لتعزيز الوسم المناعي.
- تتضمن الكيمياء النسيجية المناعية خطوات الغسل، والمعالجة بالمنشطات السطحية، والحجب، والوسم بالأجسام المضادة.
النتائج الرئيسية
- تسمح الطريقة المعدلة بالالتصاق الفعال لأنسجة القوقعة، مما يسهل الحصول على تصوير أفضل.
- يؤدي الوسم المناعي الناجح إلى تصور تفصيلي لبنى القوقعة.
- تمكن هذه التقنية من إجراء دراسات محسنة حول وظائف القوقعة وأمراضها.
- تساعد النتائج في فهم ديناميكيات تجديد الخلايا الشعرية.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة نهجاً موثوقاً لتحضير عينات القوقعة لإجراء تحليل نسيجي دقيق.
- تساعد هذه المنهجية في الدراسات المستقبلية المتعلقة بصحة القوقعة وآليات المرض.
- قد تساهم الرؤى المكتسبة في تطوير استراتيجيات علاجية تستهدف فقدان السمع وتلف الخلايا الشعرية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح تحضير سطح القوقعة إجراء تحليل نسيجي مفصل لعضو كورتي، مما يدعم التحقق من الأهداف في أبحاث السمع. وتسهل هذه الطريقة الحد من المخاطر الآلية من خلال السماح بتصور سلامة الخلايا الشعرية والبنى المشبكية، والتي تُعد بالغة الأهمية لتقييم المركبات السامة للأذن والعلاجات التجديدية. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية لفقدان السمع من خلال توفير قراءات كمية وقابلة للتكرار لأمراض القوقعة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة ببقاء الخلايا الشعرية والحفاظ على المشابك الشريطية.
- القيمة التشغيلية: يدعم التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال التقييم الكيميائي النسيجي المناعي للمؤشرات قبل المشبكية (CTBP2) وبعد المشبكية (GluA2).
- القيمة التنبؤية: يوفر الحد من المخاطر الآلية من خلال ربط التعرض للمركب بالتغيرات القابلة للقياس في مستويات البروتين المشبكي وكثافة الخلايا الشعرية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد ظهارة قوقعية ملتصقة وموحدة على شرائح تغطية مناسبة للتصوير عالي الدقة والوسم المتعدد.*
- قابلية التكرار: تقلل من فقدان الأنسجة أثناء خطوات الغسيل عن طريق استخدام لاصق للخلايا والأنسجة، مما يحسن اتساق المقايسة عبر المكررات.
- قابلية التوسع: متوافقة مع تنسيقات الآبار المتعددة، مما يسمح بالمعالجة المتوازية لشروط متعددة لفحص المركبات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: تحاكي هذه النماذج مسببات فقدان السمع، مثل التعرض للضوضاء والتسمم الأذني، من خلال فقدان كمي للخلايا الشعرية والتشابكات العصبية.
- الاستمرارية الترجمية: تعمل كجسر ينقل نتائج الاكتشافات إلى التحقق قبل السريري من خلال تمكين التقييم الطولي للتجديد وتغيرات تعبير البروتين.
- قرارات معدلة حسب المخاطر: تساهم في تحديد معايير المضي قدماً أو التوقف بناءً على النقاط النهائية البنيوية والجزيئية في عضو كورتي (organ of Corti).
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
تتكامل هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، مما يوفر تأكيداً نسيجياً لآلية العمل والسمية في علم الصيدلة الخاص بسلامة السمع.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات من خلال تصور التموضع البروتيني في الخلايا الشعرية والخلايا الداعمة تحت الظروف التجريبية.
- المسح: يوفر مخرجات كمية عبر التصوير البؤري للهياكل المووسومة مناعيًا، مما يتيح المقارنة بين مجموعات العلاج.
- التحليلات: تولد قراءات قابلة للقياس مثل تعداد المشابك الشريطية وكثافة الفلورة في الخلايا الشعرية للمقارنة الإحصائية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال تقييم علامات التجدد ومؤشرات التعافي الوظيفي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة نسيجية قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم السلامة السمعية عبر أنماط علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: زيادة الثقة في الهدف من خلال تقليل الغموض في الروابط الميكانيكية بين المركبات والنتائج القوقعية.
- القيمة التشغيلية: تعزيز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال تثبيت الأنسجة القائم على المواد اللاصقة وبروتوكولات الغسيل المحسنة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين كفاءة رأس المال من خلال تمكين الكشف المبكر عن احتمالية السمية الأذنية، مما يقلل من معدلات الفشل في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: دعم تحديد الأولويات للمركبات وفقاً للمخاطر المعدلة بناءً على الحفاظ الهيكلي لعضو كورتي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التشريح الجراحي المجهري واستخراج العظم الصدغي من الفئران البالغة.
- يعتمد على توفر كواشف إزالة الكالسيوم (EDTA)، وعوامل التثبيت (PFA)، والبنية التحتية الخاصة بالكيمياء النسيجية المناعية.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يتعلق بتوقيت التشريح، وطريقة تطبيق المادة اللاصقة، ومعايير التصوير.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق هذه التقنية على سلالات مختلفة من الفئران أو أعمار نمائية مختلفة.
- يحده المهارة التقنية المطلوبة لإجراء التشريح المجهري وتداول الأنسجة بشكل متسق، كما هو ملاحظ في منحنى التعلم الذي يتطلب من 10–15 أذناً للوصول إلى مرحلة الإتقان.
