طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس
October 29th, 2019
يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.
يستغرق تكوين الجنين C.elegans حوالي 13 ساعة ، وعادة ما يتم رصده عن طريق تصوير جنين واحد في كل مرة. ومع ذلك، يسمح بروتوكولنا بتصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد المتزامن بين 80 و100 جنين. القدرة على جمع البيانات لأعداد كبيرة من الأجنة C.elegans النامية يفتح مجموعة جديدة من التجارب، بما في ذلك التحليل الكمي للأحداث التنموية والشاشات على نطاق واسع.
ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لالتقاط عمليات النمو المختلفة أو لتصوير الأجنة التي تعبر عن أي مزيج من العلامات في الأنسجة ذات الاهتمام. من الصعب تفريق الأجنة بشكل صحيح داخل الآبار. وينبغي أن تكون قريبة من بعضها البعض لتمكين التقاط أجنة متعددة في كل حقل دون تكتل في طائرات Z مختلفة.
نوصي باستخدام اثنين من الباحثين لتشريح جنبا إلى جنب، على الجليد، وحجب الآبار غير المستخدمة. وسوف نظهر أيضا بعض الحيل المفيدة لسرعة إعداد لوحة 384-جيدا على مراحل. تبدأ عن طريق ختم لوحة 384-جيدا ذات القاع الزجاجي مع رقائق لاصقة PCR لإخفاء الآبار غير المستخدمة.
استخدام شفرة الحلاقة أو مشرط لقطع بعيدا احباط لفضح مجموعة فرعية من الآبار للاستخدام. إضافة 70 ميكرولترات من TMHC أعدت حديثا في كل بئر والحفاظ على لوحة على الجليد. استبعاد الصفين الخارجيين من اللوحة لمنع تأثيرات الحافة.
لإعداد العينة السريعة، ينصح بتشريح جنباً إلى جنب من قبل باحثين اثنين. عندما تم مطلي كل من الحل، واستخدام ملاقط غرامة ومجهر تشريح لنقل حوالي 10 البالغين الجرافيد إلى 150 ميكرولترات من الجليد الباردة TMHC الحل داخل شريحة الاكتئاب واحد لكل حالة. باستخدام الملاقط والمشرط، تشريح الديدان لإطلاق الأجنة وتحميل ماصة شعرية سحبت في طامح الفم.
استخدمي ماصة الفم لنقل كل أجنة المرحلة من اثنين إلى ثماني خلايا إلى آبار فردية من الصفيحة المعدة وفحص اللوحة للتأكد من عدم وجود مجاميع داخل أي آبار. عندما يتم جمع جميع الأجنة، قم بتسوية العينات عن طريق الطرد المركزي واستخدم مسح الإيثانول المنقوع لإزالة أي بقايا من قاع اللوحة. ضع اللوحة في حامل لوحة المجهر confocal مجهزة بيئه تحكمها في درجة الحرارة واستخدم الهدف 10X لإجراء مسح مسبق لكل بئر لتحديد الحقول مع أجنة مناسبة.
في نهاية الفحص، قم بالتبديل إلى الهدف 60X، وضبط المستوى البؤري عند كل نقطة إلى صورة حقل إلى أربعة حقول في البئر والحصول على 18 Z-الأقسام على فترات ميكرومترية كل 20 دقيقة لمدة 10 ساعات. عندما تم الحصول على جميع الصور ، وإجراء مسح منخفض ، كامل brightfield ، ما يقرب من 20 إلى 24 ساعة بعد بدء التصوير بين عشية وضحاها لتقييم الفتك الجنيني. لاقتصاص الآلي باستخدام جنينCropUI التنفيذي، أولا تحميل البرنامج من Zenodo و testfiles.
الرمز البريدي لتحديد ما إذا كان البرنامج يعمل بشكل صحيح على النظام الأساسي. مرة واحدة تحميل، بفك وانتقل إلى العثور على ملف قابل للتنفيذ embryoCropUI وانقر نقرا مزدوجا لإطلاق البرنامج. حدد فتح لتحميل حقل عرض 4D المحدد الأول للحصد.
عند اقتصاص سلسلة TIFF مع أبعاد متعددة تحميل الصورة الأولى فقط في السلسلة داخل المجلد. عند تحميل كافة الصور تحديد معلمات التصوير، حدد الطرح الخلفية وتصحيح التوهين، وتعيين ترتيب مجموعة الصور والميكرنات لكل بكسل. ثم حدد تشغيل، سيتم إنشاء قص مجلد فرعي جديد يسمى في نفس المسار مثل المجلد غير المُنقط وسيتم حفظ الإصدارات المقتصة في هذا الموقع.
للتصور، تحميل البرنامج المساعد MSV2 ImageJ مفتوحة ومدمجة وتعليمات واجهة المستخدم الرسومية Zenodorepov2. docx من زنودو وفتح البرنامج المساعد في IMageJ. حدد موقع الأسطر ثلاثة وأربعة وإدخال الموقع الذي سيتم تخزين مجلدات الصور فيه بعد الاقتصاص.
أسماء مجلد الصور للشروط التي سيتم معالجتها، ومعرف أبجدي رقمي فريد لكل تجربة ليلية. عند إدخال كافة المعلومات، انقر فوق تشغيل. ستظهر نافذة ستقوم بتشغيل مطالبة بالانتقال إلى المجلد الخارجي الذي يحتوي على مجلدات الصور التي تم اقتصاصها.
بمجرد تحديد نافذة أخرى سوف تظهر والتي سوف تسمح مواصفات المعلمات التصوير. انقر فوق "حسناً". سيبدأ الملف المركب في التجميع.
عند إنشاء المركب، راجع الملفات التي يتم تركها مفتوحة. عندما صورت في سلالات مراسل مخصص جنبا إلى جنب توفير قراءات مفيدة لمعظم الأحداث التنموية الكبرى. بما في ذلك مواصفات كبريتات، التشابك الظهرية، الضميمة البشرة، الممدة، والنشوء العصبي.
بعد 24 ساعة من الحقن هو الوقت الأمثل للتصوير. اعتبارا من هذا الوقت استنفاد البروتين الأمومي وتثبيط التعبير الجيني الزيجوتيك كلاهما فعالة تسفر عن متميزة، والأنماط الظاهرية التوقيع استنساخها للغاية عبر مجموعة واسعة من الجينات المشاركة في مواصفات كبريتات وmorphogenesis. من المهم أن يكون المريض أثناء تشريح والخطوات اختيار الجنين.
والتقليل من التكتل واختيار المعطيات البؤرية المناسبة أمران أساسيان أيضاً لضمان جودة البيانات. يمكن تنفيذ بروتوكول لدينا مع مجموعة متنوعة من سلالات علامة الفلورسنت و بالاشتراك مع RNAi أو المسوخ. تسمح أدوات المعالجة لدينا بتحليل البيانات المبسط أو الآلي أو اليدوي.
باستخدام السلالات، والأساليب، والأدوات الموصوفة هنا، قامت مجموعتنا بإجراء شاشة محتوى عالي قائم على RNAi تستهدف ما يقرب من 2000 جينات مطلوبة للتنمية الجنينية. كانت طرق الإنتاجية شبه عالية ضرورية لهذا المشروع.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا العمل بروتوكولًا شبه عالي الإنتاجية يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد بمرور الوقت المتزامن لعملية تكوين الأجنة في 80-100 جنين من نوع C. elegans في تشغيلة واحدة طوال الليل. تتيح القدرة على جمع البيانات لأعداد كبيرة من أجنة C. elegans النامية مجموعة جديدة من التجارب، بما في ذلك التحليل الكمي لأحداث التطور.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- تقنيات التصوير
الخلفية
- تستغرق عملية تكوين الأجنة لـ C. elegans حوالي 13 ساعة.
- تتضمن الطرق التقليدية تصوير جنين واحد في كل مرة.
- يتيح التصوير المتزامن جمع بيانات أكثر شمولاً.
- يمكن استخدام سلالات المؤشرات المخصصة للمراقبة التفصيلية.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول للتصوير عالي الإنتاجية لأجنة C. elegans.
- تمكين التحليل الكمي للعمليات التنموية.
- تسهيل الفحص واسع النطاق للتطور الجنيني.
الطرق المستخدمة
- بروتوكول تصوير ثلاثي الأبعاد بمرور الوقت شبه عالي الإنتاجية.
- أدوات معالجة الصور والتصور لتحليل البيانات.
- سلالات مؤشرات مخصصة لمراقبة علامات تطورية معينة.
- تكييف البروتوكول لمختلف العمليات التنموية.
النتائج الرئيسية
- التصوير المتزامن الناجح لـ 80-100 جنين.
- تحليل البيانات المبسط من خلال الأدوات المخصصة.
- قدرة محسنة على مراقبة تكوين الأجنة بالتفصيل.
- إمكانية التكيف مع الاحتياجات التجريبية المختلفة.
الاستنتاجات
- يزيد البروتوكول بشكل كبير من كفاءة دراسات تكوين الأجنة.
- يفتح إمكانيات جديدة للتحليل الكمي في علم الأحياء التنموي.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية عمليات تنموية مختلفة ومجموعات من المؤشرات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Semi-high-throughput 3D imaging of C. elegans embryogenesis enables quantitative, multiplexed analysis of developmental phenotypes across multiple genetic or experimental conditions. This capability accelerates early discovery by supporting large-scale, parallelized hypothesis testing and mechanistic de-risking in developmental biology. The approach enhances predictive confidence and portfolio triage for gene function and pathway interrogation in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function during embryonic development.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing phenotypic outcomes across diverse genetic perturbations.
- Facilitates high-content screening for target validation and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes imaging and data processing for reproducible, quantitative outputs.
- Enables scalable, parallel evaluation of gene knockdowns or compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic readouts with disease-relevant developmental processes when using informative reporter strains.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis workflow bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling multiplexed, quantitative phenotyping in a model organism system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-content, parallelized imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for large-scale genetic or compound screens.
- Analytics: Provides automated cropping, orientation, and visualization tools for standardized data analysis.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to disease-relevant biological processes when using appropriate markers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform adaptable to diverse experimental needs and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental gene function studies.
- Operational Value: Streamlines data acquisition, processing, and visualization for high-throughput experiments.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires microscopy infrastructure with point visiting and temperature control capabilities.
- Demands expertise in embryo handling, imaging, and data analysis workflows.
- Benefits from cross-team standardization of imaging parameters and data processing protocols.
- Adaptable to various fluorescent marker strains and genetic backgrounds.
- Dependent on careful sample preparation to avoid embryo clumping and ensure data quality.
