وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

هذا البروتوكول هو الأسلوب الأكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لوضع العلامات بدقة على لويحات بيتا اميلويد، بالمقارنة مع الأجسام المضادة الأميلويد محددة، والتي هي حاليا المعيار الذهبي لوضع العلامات على هذه اللويحات. تستغرق هذه التقنية وقتًا أقل وهي فعالة بنفس القدر مثل أي من طرق وضع العلامات على الأميلويد شائعة الاستخدام. الكركمين يرتبط بقوة لويحات اميلويد ويمكن استخدامها كمسبار التصوير أثناء مسح PET للدماغ وللفحص غير الباضع نسبيا باستخدام مسح شبكية العين.

الكركمين يرتبط أيضا إلى الرجفان العصبي أو تاو متشابكة في مرض الزهايمر، ألفا synuclein في مرض باركنسون، وبروينات هنتنغتون متحولة في مرض هنتنغتون. إظهار الإجراء مع Panchanan Maiti سيكون زاكاري باورز، وهو طالب دراسات عليا، وأليكساندرا بلمونز، عالمة أبحاث من مختبري. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لاعكاس الألم في تخدير 12 شهرا من العمر مرض الزهايمر الماوس نموذج, وضع الماوس في موقف supine على علبة جراحة وجعل شق في البطن ومن خلال الحجاب الحاجز.

أدخل إبرة 21 مقياساً في الشق، ثم قم بعمل شق صغير في فتحة اليورين اليمنى للسماح لسائل النزف بالتصريف من الجسم. استخدام نظام ضخ تغذية الجاذبية للسماح للثلج الباردة 0.1 السائل PBS ضرس للتدفق في الإبرة لمدة خمس إلى ست دقائق في 20 إلى 25 ملليلتر في الدقيقة معدل التدفق. إذا تم إجراء التسريب بشكل صحيح، سيتم ملاحظة الكبد واضحة.

إن القذف السليم للحيوان ضروري لأنه إذا لم تتم إزالة الدم تمامًا ، فقد يرتبط الكركمين بالأوعية الدموية ويؤدي إلى إشارة خلفية فلورية خضراء. عندما تم تسليم كل من برنامج تلفزيوني، تبديل صمام العازلة إلى الجليد الباردة 4٪ حل شبهformaldehyde لمدة ثماني إلى 10 دقائق قبل استخدام مقص ملقط لتحرير الدماغ من الجمجمة. ثم استخدم ملعقة لوضع الدماغ في قارورة 4٪ شبهformaldehyde على الأقل 10 أضعاف حجم الأنسجة لمدة أربع درجات مئوية التخزين حتى المعالجة.

للحصول على أقسام لاقسام التبريد ، تزج بشكل متتابع الدماغ في حلول السكروز متدرج في أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة لكل تركيز قبل استخدام التبريد في درجة حرارة سالبة 22 درجة مئوية للحصول على 40 ميكرومتر أقسام ، ووضع 10 إلى 20 قسما في بئر في ستة بئر لوحة تحتوي على برنامج تلفزيوني تكملها 0.02 ٪ azide كما يتم الحصول عليها. عندما تم الحصول على جميع العينات، تخزين الأجزاء في أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. للحصول على أقسام لاقتناف البارافين، يجفف أنسجة الدماغ المجففة بعد ثابت مع حلول الكحول متدرج متسلسلة لمدة ساعتين لكل تركيز، تليها اثنين ساعة واحدة 100٪ الكحول الغمر واثنين من الغمرات إكسيلين ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الغمر الزيلين الماضي، واختراق الأنسجة مع واحد إلى واحد من الزيلين إلى محلول البارافين مرتين لمدة ساعة واحدة لكل حضانة في 56 درجة مئوية في كوب مخروطي زجاجي مغطى برقائق الألومنيوم قبل غمر الأنسجة في البارافين درجة مئوية 56 لمدة أربع إلى ست ساعات. في نهاية الحضانة، واستخدام microtome دوارة في درجة حرارة الغرفة للحصول على خمسة أجزاء سميكة ميكرومتر وضع المقاطع في 45 درجة مئوية حمام الماء الأنسجة كما يتم جمعها. لتكريم الكركمين من لويحات بيتا اميلويد في أقسام الأنسجة المبردة، شطف المقاطع مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل قبل غمر المقاطع في 70٪ الإيثانول لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

في حين أن المقاطع هي احتضان، حل مليمولار واحد من الكركمين الأسهم في الميثانول وتمييع الحل لتركيز العمل النهائي من 10 ميكرومولار مع 70٪ الإيثانول. في نهاية الحضانة، غمر المقاطع في محلول الكركمين العامل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 50 دوران في الدقيقة. في نهاية فترة تلطيخ، والتخلص من محلول الكركمين وغسل المقاطع مع ثلاثة غسل دقيقتين في 70٪ الإيثانول.

بعد الغسيل الأخير، قم بنقل المقاطع إلى شرائح زجاجية مغلفة بالبوليسين واركب زلة غلاف على كل شريحة مع وسيط تركيب عضوي مناسب. ثم عرض المقاطع على مجهر الفلوريسنس باستخدام هدف 10 أو 20x ومرشحات الإثارة المناسبة والانبعاثات. لوضع العلامات الهستوكيميائية من أقسام الأنسجة البارافينية العميقة، غمر الأجزاء السميكة الخمسة ميكرومتر في إكسيلين مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل غمر، تليها الإماهة مع متدرجة دقيقة واحدة حل الكحول الغمر.

في نهاية الحضانة، وغسل المقاطع مع حلول الكحول متدرج لمدة دقيقتين لكل تركيز تليها إزالة مع اثنين من الغمرات الزيلين خمس دقائق. بعد الغمر الإكسلين الثاني، جبل كل قسم على شريحة المجهر مع زلة غطاء ووسيلة تركيب مناسبة للتصوير المجهري فلوريسنس كما هو موضح. لوضع العلامات من عينات قسم التبريد مع الأجسام المضادة المضادة A-بيتا، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل في آبار فردية من 12 لوحة جيدا قبل عرقلة أي ربط غير محددة مع مصل الماعز العادي 10٪ في برنامج تلفزيوني و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، والتخلص من حل حجب واحتضان العينات مع الأجسام المضادة بيتا محددة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية و 150 التناوب في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، وغسل المقاطع مع ثلاثة 10 غسل دقيقة في برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل، تليها الحضانة مع جسم مضاد الثانوية المناسبة مترافق مع الفلوروفور الأحمر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل أقسام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني تليها غسل واحد مع 70٪ الكحول.

بعد غسل الكحول، احتضان المقاطع مع 10 الكركمين ميكرومولار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاث دقيقة واحدة 70٪ يغسل الكحول. بعد الغسيل الأخير، قم بتجفيف المقاطع بنسبة 90٪ و100٪ من الكحول لمدة دقيقة واحدة لكل تركيز، وامسح الأقسام مرتين لمدة خمس دقائق لكل غمر مع الزيلين الطازج لكل حضانة. ثم قم بتحميل المقاطع وصورها كما هو موضح.

بالنسبة لـ amyloid beta co-التعريب، وصمة عار المقاطع مع الأجسام المضادة بيتا اميلويد تليها تلطيخ مع الكركمين في درجة حرارة الغرفة و 50 التناوب في الدقيقة المحمية من الضوء كما هو موضح. في نهاية الحضانة، مضاد مع صبغة نووية مناسبة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 50 دوران في الدقيقة المحمية من الضوء تليها ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني. ثم جبل وصورة المقاطع عن طريق المجهر fluorescence كما هو موضح.

على الرغم من زيادة وقت الحضانة مع الكركمين يزيد قليلا من شدة الفلوريسنس من لويحات بيتا A، وعدد من لويحات لوحظ لا يختلف كثيرا بين دقيقة واحدة وخمس دقائق من الوقت تلطيخ. الكركمين يمكن استخدامها لطخة اللويحات بيتا و اكيبيبات، البارافين جزءا لا يتجزأ، وعينات الأنسجة مرض الزهايمر البشري. وضع العلامات مع جسم مضاد بيتا محددة قبل تلطيخ الكركمين يكشف أن الكركمين هو تماما شارك في ترجمة مع بيتا في نفس اللويحات التي تربط الجسم المضاد.

بعد تلطيخ مع الكركمين المسمى A أوليجومر بيتا، الكركمين شارك التعريب مع oligomers يمكن ملاحظتها في لويحات بيتا. وبالمثل، الكركمين أيضا شارك في ترجمة مع الأجسام المضادة بيتا محددة في المساحات داخل الخلايا، مؤكدا أن وصمة عار يمكن تسمية بيتا داخل الخلايا. الكركمين وسم هو أيضا أكثر بروزا من الأصباغ التقليدية الأميلويد ملزمة.

مشتقات الكركمين الموجودة في مقتطفات من التكريمي تسمية اللويحات بيتا نسبيا إلى الكركمين في أنسجة الدماغ مرض الزهايمر البشري بغض النظر عن نوع المتوسطة المتصاعدة المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الحفاظ على إشارات الكركمين المناعية وكثافة مكافحة الملوثات حتى بعد تلطيخ مع البقع النووية النموذجية وعلامات الخلية الأخرى. التقينا أن المقاطع الثابتة يجب أن تكون أرق من 40 ميكرون.

يجب أن يبقى هذا الإجراء التدريب أقل من 30 دقيقة والتركيز الكركمين الأمثل هو واحد إلى اثنين من micromolar. يمكن إجراء المؤشرات الحيوية المتخلفة المزدوجة على نفس الأنسجة ويمكن أن توفر خصوصية أكبر لأنواع خلايا الدماغ التي يتم تسويةها. وبالنظر إلى أن الكركمين يمكن أن تقلل من حمولة البلاك اميلويد، ويجري حاليا التحقيق في الآليات الدقيقة لكيفية حدوث هذه العملية على المستويين الخلوي والجزيئي.