في الوقت الحقيقي التصوير الضوئي التلالؤ من الدرجة ديناميات الإشارات اثناء التكوين العصبي Murine

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول أهمية ديناميات التعبير الجيني في انتشار الخلايا والتمايز ، ولا سيما ديناميات جزيئات إشارات الناوتش في الخلايا الجذعية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا مراقبة التعبير الجيني في المختبر وفي الجسم الحي بدقة عالية جدًا عن طريق التصوير المباشر. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون هيرومي شيموجو، الأستاذ المساعد من مختبري الذي طور هذه التقنية الجديدة.

لDd1 F لوسيفيراز تقديم مراسل في المجلس الوطني للصحافة، تأكيد عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في يوم الجنين 12.5 إلى 14.5 فأرة حامل قبل إجراء شق من 2 إلى 3 سنتيمترات من خلال البطن، على طول خط الوسط. ضع شاشًا مبللًا PBS حول الشق ، واستخدم ملقطًا على شكل حلقة لاستخراج قرن الرحم الأيمن بعناية. بعد عد الأجنة، واستخدام شعري صغير لحقن واحد إلى اثنين microliters من الحمض النووي مراسل Dll1 F luciferase مختلطة في البطين من تيلنسيفلون من كل جنين.

الحقنة الناجحة سوف تؤدي إلى مراعاة الصبغة الزرقاء على سطح الرحم. للكهربة، الرطب الرحم والأقطاب الكهربائية مع برنامج تلفزيوني، وبسبل بلطف رأس الجنين الأول. تعيين القطب مشحونة إيجابيا إلى جانب نصف الكرة الأرضية الذي تم حقن الحمض النووي، وتوفير خمس نبضات 30-50 فولت، 50 مللي ثانية، مع وقفة ثانية واحدة بين البقول، والتحقق من أن يتم توليد فقاعات من القطب المشحون سلبا.

عندما تم حقن جميع الأجنة ، وإعادة القرن الرحم الأيسر إلى البطن ، واستخدام إبرة 17 ملليمتر لإغلاق الشق مع خياطة الحرير 4-0 ، ووضع PBS دافئ في تجويف البطن قبل الانتهاء من الإغلاق. لإقامة ثقافة المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني المنفصلة، ضع أولا الرحم من يوم جنيني 12.5 إلى 14.5 حامل Dll1 في كل مكان لوسيفيراز الماوس المعدل وراثيا في طبق بيتري 10 سنتيمترات يحتوي على 25 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني، واستخدام مقص صغير والملقط غرامة لإزالة الأجنة من الرحم. بعد قطع رؤوس الأجنة، ضع الرؤوس في طبق بيتري جديد طوله 10 سنتيمترات يحتوي على DMEM/F12 بارد الجليد، وأزل البشرة والغضاريف المحيطة بكل دماغ.

نقل العقول إلى طبق 35 ملليمتر تحت مجهر تشريح يحتوي على ثلاثة ملليلترات من الجليد الباردة N2B27 المتوسطة. إزالة تيلينسيفال الأيمن والأيسر من diencephalon. استخدام ملقط غرامة لإزالة السحايا التي تغطي سطح التيلنسفالون وتشريح الجزء الظهري من القشرة من التيبنسفالون.

عندما تم عزل جميع الأنسجة العصبية ذات الاهتمام ، استخدم ماصة P1000 لنقل العينات إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر ، واستخدام ماصة P200 لpirate أي وسيط إضافي من كل أنبوب. إضافة 100 ميكرولترات من محلول باباين في زوج القشرة، ووضع العينات في 24 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. في نهاية الحضانة، ماص بلطف العينات 10 مرات مع ماصة P1000 جديدة، والعودة الأنابيب إلى 24 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية.

في نهاية الحضانة ، الماصات بلطف العينات مرة أخرى قبل جمع الأنسجة المهضمة عن طريق الطرد المركزي. استلهموا من المُتطَعِدين، و اِعيدَ اِنْتِفِق كلّ بيليه برفق مع مليلتر واحد من متوسطة DMEM/F12. الطرد المركزي العينات ثلاث مرات أكثر كما أظهرت للتو، بلطف إعادة تعليق كل بيليه مع ملليلتر جديدة من المتوسط بعد كل طرد مركزي.

بعد الطرد المركزي الأخير، resuspend الكريات في 500 ميكرولتررس من N2B27 المتوسطة تكملها لوسيفرين واحد مليمولار، والبذور مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست من كل عينة على الفردية بولي-L-lysine المغلفة الأطباق القاع الزجاجي. ثم ضع اللوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة. مرة واحدة وقد التزمت الخلايا إلى الطبق، إضافة ملليلتر اثنين من N2B27 المتوسطة الطازجة بالإضافة إلى لوسيفرين واحد ملليمتر إلى كل لوحة.

لتصور التعبير عن مراسل luciferase في الثقافات تفكك المجلس الوطني للصحافة، حدد هدف الغمر النفط، ووضع طبق عينة على مرحلة المجهر. عرض الحقل يدوياً لتحديد الموضع الأفضل لعرض الخلايا، والتركيز على الخلايا التي تهمك. انقر فوق Live للحصول على صورة الاختبار، واستخدم برنامج الاكتساب متعدد الأبعاد لتشغيل عملية الاستحواذ على الفاصل الزمني بواسطة الإنارة ثنائية الأبعاد والاستحواذات في المجال الساطع لمدة 24 ساعة.

لإعداد الثقافات شريحة القشرة النامية، بعد يوم واحد من حقن المراسل، حصاد اليوم الجنيني 13.5 إلى 14.5 أدمغة الجنين كما هو موضح، ووضع الطبق الذي يحتوي على العقول على خشبة مسرح المجهر المتناظر الفلوري. تأكد من أن كل قشرة تعبر عن المراسل الفلورسنت المحقون تحت ضوء الإثارة المناسب ، ونقل الأدمغة إلى لوحة قطع مطاطية سيليكون مليئة بـ 30 ملليلتر من DMEM /F12 المتوسطة ، مع غاز الأكسجين بنسبة 100٪. استخدام سكين الجراحية الدقيقة والملقط غرامة لقطع الحدود بين الجزء الوسطي والجزء الجانبي من التيلسيفال الظهرية، وفصل الأنسجة إلى نصفين.

ثم، استخدم السكين لقطع القشرة مثل المشارب للحصول على شرائح القشرية، ونقل الشرائح في المتوسط من لوحة القطع إلى طبق بيتري جديد من عيار 35 ملليمتراً عند الحصول عليها. عندما تم جمع جميع الشرائح، ضع سطح القطع لكل شريحة على إدراج الثقافة مجموعة في طبق القاع الزجاجي التي تحتوي على المتوسطة المخصبة، وضبط اتجاه كل شريحة مع ملقط غرامة حسب الضرورة. ثم، إزالة أي متوسطة زائدة مع ماصة، ووضع الطبق في حاضنة متعددة الغاز تعيين إلى 40٪ الأكسجين، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة، إضافة 300 ميكرولترات من المتوسطة المخصب تستكمل مع لوسيفرين واحد مليمولار إلى طبق الثقافة. لتصور تعبير المراسل luciferase داخل الثقافات شريحة، حدد الهدف 40x، ووضع طبق العينة على مرحلة المجهر. الحصول على صورة اختبار من الفلوريسنس، وتعيين الموقف والتركيز على مستوى المنطقة ذات الاهتمام تحت إضاءة ضوء الإثارة المناسبة.

ثم، تشغيل عملية الاستحواذ على الفاصل الزمني من خلال الإنارة ثلاثية الأبعاد، الفلوريسنس، والاستحواذات في المجال الساطع لمدة 24 ساعة. لرصد نشاط المروج من تذبذب الجينات Dll1، يمكن استخدام لوسيفيراز في كل مكان، وهو مراسل لوسيفيراز زعزعة الاستقرار مع نصف عمر حوالي 10 دقيقة. مثل مراسل الفلورسنت، يمكن استخدام مراسل luciferase لمراقبة ديناميات التعبير من البروتين من خلال دمجها في تسلسل الترميز الجيني من الفائدة.

لتصور التعبير مراسل على مستوى خلية واحدة في الثقافات الأنسجة، يمكن أن يكون جين مراسل عابرة عابرة في الشخصيات عبر في الكهربائي الرحم كما هو موضح. وبالإضافة إلى ذلك، تمكن الصور المستندة إلى المجهر من الحصول على صور المجال المشرق، والفلور، و chemiluminescence. مراسل Dll1 المروج النشاط معارض تعبير متذبذب في NPCs المستمدة من telencephalon من Dll1 في كل مكان F لوسيفيراز مراسل الفئران، مع مراسل لوسيفيراز زعزعة الاستقرار مما يشير إلى تنظيم حاد صعودا وهبوطا للتعبير عن نشاط المروج.

في الخلايا الخضراء المعززة المعززة للبروتين الإيجابي تحمل مراسل Hes1 وخلايا MCherry الإيجابية التي تعبر عن مراسل بروتين Dll1 الذي أجرى اتصالًا مع بعضها البعض أثناء الملاحظة ، يبدو أن تعبير مراسل Hes1 يبدأ بعد حوالي 60 دقيقة بعد الاتصال ، مما يشير إلى أن التأخير الزمني لإرسال إشارات Notch بين الخلايا المجاورة حوالي ساعة واحدة. وعلاوة على ذلك، أثناء انتقال الإشارة، يسلك تعبير بروتين Dll1 نقلًا ديناميكيًا. عند الحصول على التصوير بالإضاءة الحيوية، والحفاظ على غرفة المجهر مظلمة تماما، كما يمكن للضوء الدخيل منع الحصول على الأمثل.

التطورات الأخيرة في علم الوراثة البصرية يسمح لنا للسيطرة على التعبير الجيني مع الضوء. مع هذه التقنية، يمكننا أن نقدم في وقت واحد نمط مختلف من التعبير الجيني ورصد ردود المراسل luciferase.