تحديد المسارات المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية باستخدام سميه الخميرة والشاشات المثبطة
October 25th, 2019
تفرز مسببات الامراض البكتيرية البروتينات في المضيف الذي يستهدف العمليات البيولوجية الحاسمة. تحديد مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات البكتيرية هو المفتاح لمعالجه التسبب في الجزيئات. هنا ، يتم وصف طريقه باستخدام المثبطة الخميرة المعدلة والشاشة سميه لتوضيح مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات السمية البكتيرية المستجيب.
تفرز البكتيريا داخل الخلايا بروتينات التأثير إلى المضيف التي يمكن أن تتلاعب بالمسارات البيولوجية لتعزيز البقاء على قيد الحياة الممرض. الكشف عن الأهداف المضيفة من الآثار أمر ضروري لفهم مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل الكلاميديا trachomatis. يمكن لسمية الخميرة وشاشات القامع توفير رؤية رئيسية فيما يتعلق بالهدف البيولوجي الطبيعي للبروتينات البكتيرية والمفعمة ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص عندما يكون الشريك الملزم غير معروف.
نحن نبرهن على سمية الخميرة والفحوصات القامعة هنا للفحص للبروتينات المسببة للتشاليديا تراشوتاتيس ، ولكن هذه التقنية استخدمت أيضًا لتميز الفيلقية pneumophila و Coxiella burnetii effectors. تبدأ من قبل تلقيح خمسة ملليلتر من مرق واحد التسرب مع مستعمرة واحدة من الخميرة تحولت مع البروتين effector التي تحتوي على plasmid. استخدام الخميرة تحول مع ناقلات وحدها كتحكم سلبي واحتضان inoculum بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في حين تهتز.
في اليوم التالي، أضف 180 ميكرولترات من المياه المعقمة إلى آبار A2 من خلال A6 من طبق 96 بئرًا. دوامة ثقافة بين عشية وضحاها وإضافة 180 ميكرولترات من الخميرة إلى A1 جيدا. ثم تخفيف تسلسلي الخميرة في الآبار بالماء. استخدام ماصة متعددة القنوات لاكتشاف خمسة ميكروليتر من كل تخفيف على الجلوكوز قطرة واحدة وألواح واحدة من تسرب أغر واحتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
بعد الحضانة، وتقييم بصريا سمية عن طريق مقارنة نمو الخميرة التعبير عن البروتين effector نمت على الوسائط المحتوية على جالاكتوز إلى نمو الخميرة التعبير عن ناقلات وحدها. تلقيح 100 ملليلتر من مرق التسرب واحد مع ملليلتر واحد من مخزون الخميرة المعدة سابقا واحتضانه لمدة 16 إلى 24 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، إضافة كامل 100 ملليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها إلى 900 ملليلتر من قبل الدافئة مرق التسرب واحد واحتضان القارورة لمدة أربع إلى خمس ساعات في 30 درجة مئوية في حين تهتز.
بعد الاحتضان، بيليه الثقافة في 6،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تخلص من السوبر و resuspend بيليه في 250 ملليلتر من الماء المعقم. كرر الطرد المركزي وتجاهل المابير.
ثم إعادة تعليق بيليه في 250 ملليلتر من خلات الليثيوم ميليمولار واحد. بيليه الثقافة عن طريق الطرد المركزي، وإزالة خلات الليثيوم، وإعادة تعليق بيليه في 9.6 ملليلتر من 50٪ PEG 3350. ثم أضف الكواشف التحويلية كما هو موضح في المخطوطة، وقم بتعديل الحجم إلى 15 ملليلتر مع قلب الماء المعقم بلطف للمزج.
احتضان الخليط في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة 750 ميكرولترات من DMSO واحتضان في حمام مائي في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. إضافة DMSO قبل الصدمة الحرارية أمر بالغ الأهمية لتحقيق كفاءة عالية التحول.
بعد الحضانة، بيليه الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 3، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وغسل بيليه مع 10 ملليلتر من الماء العقيم ثم كرر الطرد المركزي ل بيليه الخميرة. إعادة تعليق بيليه في ثمانية ملليلتر من الماء.
تحديد كفاءة التحول عن طريق تمييع العينة من واحد إلى 10 والطلاء 100 ميكرولترات من كل تخفيف على مزدوجة الأجار التسرب. ثم لوحة 200 ميكروليتر من العينة على مزدوجة التسرب لوحات جالاكتوز أجار واحتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 إلى 96 ساعة أو حتى تظهر المستعمرات. بمجرد ظهور المستعمرات ، التصحيح لهم على تسرب مزدوج galactose أجار واحتضان لهم لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى.
استخدام جزء من التصحيح لتطعيم خمسة ملليلتر من مرق التسرب المزدوج واحتضان inoculum بين عشية وضحاها في 26 درجة مئوية مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، إضافة 180 ميكرولترات من الماء المعقم إلى خمسة آبار من لوحة 96 جيدا بدءا من A2 جيدا. دوامة مزيج ثقافة بين عشية وضحاها. إضافة 180 ميكرولترات من الخميرة إلى A1 جيدا وتمييع تسلسلي باستخدام الماء في الآبار A2 من خلال A6. بقعة خمسة ميكرولترات من كل تخفيف على الجلوكوز واحد التسرب وألواح واحدة من تسرب جالاكتوز أجار مع التأكد من إدراج المفعول السام وحده كتحكم.
احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ثم قارن نمو الخميرة مع التأثير السام وحده إلى نمو الخميرة مع القامع المحتملة. لتأكيد القامعين التي أظهرت انخفاض السمية بالمقارنة مع الأثر السام وحده، عزل البلازميد وفقا لاتجاهات المخطوطات وإعادة تحويله إلى الخميرة السامة. تلقيح مرق الجلوكوز المتسرب المزدوج مع مستعمرة من لوحة التحول.
احتضانه بين عشية وضحاها وعلى الفور على السكر المزدوج التسرب و galactose أجار لتأكيد قمع السمية. قبل إجراء شاشة القامع الخميرة، تم اختبار البروتينات ذات الأهمية من أجل سمية في الخميرة. تم التعبير عن البروتين من الفائدة في الخميرة تحت سيطرة المروج galactose غير قابل للدبوس، ومقارنة النمو على جالاكتوز إلى النمو على الجلوكوز.
عندما تم اختبار CT229 لسمية، لوحظ المستعمرات أصغر وإخماد النمو. من الناحية المثالية، ينبغي ملاحظة انخفاض سجل اثنين إلى ثلاثة للمضي قدما مع شاشات القامع الخميرة. أجريت شاشة القامع عن طريق تحويل سلالة سامة مع مكتبة الخميرة الجينوم PYAP 13 والطلاء التحويلات على غالاكتوز أجار.
تم رصد المستنسخات القامع التي تم الحصول عليها على مزدوجة التسرب galactose أجار لتأكيد قمع السمية. قمع pSup1 وpSup2 قمعت سمية البروتين effector في حين pSup3 لم. وتتطلب هذه الإجراءات اهتماماً دقيقاً بالتفاصيل بالإضافة إلى الأعمال التحضيرية الحاسمة بما في ذلك وجود كميات كبيرة من الوسائط واللوحات جاهزة قبل إجراء التجربة.
وبمجرد تحديد القامعين، يمكن إجراء التجارب للتحقق من التفاعلات مع المؤثرات من الفائدة بما في ذلك سحب هبوطا، الكولويولوجيا المناعية، ضربة قاضية من المؤثر أو الضربة القاضية من العوامل المضيفة التي تم تحديدها في الشاشات. وقد سمح تطوير هذه التقنية لمؤاذيات الكلاميديا للتوصيف الأولي المعجل للبروتينات المُفعِّلة وساعد على تركيز جهودنا على توضيح الآليات الجزيئية الأساسية التي تتوسط التفاعلات المُضيفة للمُمرضات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لتحديد مسارات المضيف المستهدفة بواسطة بروتينات المفعّلات البكتيرية السامة باستخدام نماذج السمّية للمخمّر ونماذج الكوابح. يعد فهم هذه التفاعلات أمرًا بالغ الأهمية لمعالجة التسبب في الأمراض الجزيئية في البكتيريا داخل الخلايا مثل الكلاميديا التراخومية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- تفاعلات الممرض-المضيف
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تفرز الممرضات البكتيرية بروتينات المفعّلات التي تتحكم في المسارات البيولوجية للمضيف.
- تحديد هذه المسارات ضروري لفهم الأمراض التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا.
- يمكن استخدام نماذج المخمّر لفحص آثار هذه البروتينات المفعّلة.
- تم تطبيق هذه الطريقة على مسببات الأمراض المختلفة، بما في ذلك الكلاميديا التراخومية.
هدف الدراسة
- لتوضيح مسارات المضيف المستهدفة بواسطة بروتينات المفعّلات البكتيرية السامة.
- لتوفير رؤى حول الآليات الجزيئية للتسبب في الأمراض.
- لإظهار فائدة نماذج سمّية المخمّر ونماذج الكوابح في هذا المجال من البحث.
الطرق المستخدمة
- زرع المخمّر المحول بالبلازميدات المحتوية على بروتينات المفعّلات.
- استخدام الضوابط السلبية مع المخمّر المحول بالمتجه فقط.
- حضانة الثقافات عند 30 درجة مئوية مع رجها.
- تحليل نمو المخمّر وسمّيته لتحديد تفاعلات بروتينات المفعّلات.
النتائج الرئيسية
- التحديد الناجح للمسارات المضيفية المتأثرة ببروتينات المفعّلات الخاصة بالكلاميديا التراخومية.
- تبيان فعالية نماذج المخمّر في دراسة المفعّلات البكتيرية.
- رؤى حول الأهداف البيولوجية لمختلف مسببات الأمراض البكتيرية.
- تطبيقات محتملة لهذه الطريقة لبكتيريا داخل الخلايا الأخرى.
الاستنتاجات
- تعد نماذج سمّية المخمّر ونماذج الكوابح أدوات قيمة لدراسة بروتينات المفعّلات البكتيرية.
- يعزز هذا النهج فهم تفاعلات الممرض-المضيف.
- يمكن أن تؤدي الأبحاث الإضافية باستخدام هذه الطريقة إلى استراتيجيات علاجية جديدة ضد الالتهابات البكتيرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Identifying host pathways manipulated by bacterial effector proteins is critical for de-risking target validation in anti-infective discovery. Yeast toxicity and suppressor screens provide a functional, phenotype-driven approach to pinpoint dysregulated host biology when traditional binding assays fail. This enables mechanistic insight into pathogen virulence factors, supporting early-stage target confidence and portfolio prioritization for intracellular pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking effector toxicity to specific host pathways through suppressor identification.
- Operational Value: Enables functional target validation when effector proteins lack detectable binding partners or interact with multifunctional host proteins.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-level perturbations rather than isolated protein interactions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated yeast strains expressing effector proteins for reproducible toxicity screening.
- Quantitative Output: Measures growth defect magnitude (e.g., two- to three-log reduction) as a threshold for proceeding to suppressor screens.
- Scalability: Uses 96-well formats and serial dilution spotting for high-throughput suppressor clone evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to intracellular pathogens like Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, and Coxiella burnetii, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Identifies host factors that, when suppressed, rescue effector toxicity, enabling follow-up validation via pull-downs, colocalization, or knockout studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses efforts on effectors with confirmed pathway modulation, reducing late-stage biological attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to inform lead identification by connecting effector expression to host pathway disruption, enabling data-driven target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking effector expression to growth defects in yeast, indicating pathway interference.
- Screening: Delivers assay-ready toxic strains and suppressor libraries for identifying host factors that rescue phenotype.
- Analytics: Provides quantitative growth readouts on selective media to compare effector toxicity and suppressor efficacy.
- Translational Research: Connects yeast-identified suppressors to mammalian homologs for preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening effector libraries across multiple intracellular pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through functional pathway interrogation.
- Operational Value: Standardized toxicity and suppressor screening workflows with defined growth thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by filtering effectors lacking measurable host pathway impact.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of effector targets based on validated pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular cloning, galactose-inducible expression, and plasmid library transformation.
- Dependent on instrumentation for sterile culture handling, centrifugation, and incubation at 30°C with shaking.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, plate spotting, and toxicity scoring criteria.
- Adaptation considerations include promoter compatibility, effector toxicity thresholds, and suppressor validation in mammalian systems.
- Practical limitations include the need for large volumes of media and plates, and potential false negatives if effector expression is toxic to yeast library strains.
