Name: التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: تعلم تشريح الخلايا الزيتية وتلطيخ الدهون القطرة في يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام صبغة BODIPY 493/503. تتيح هذه الطريقة دراسة استقلاب الدهون في الحشرات والثدييات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وكان هذا العمل مدعوما بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671422 ، 31529004 ، 31601112) ، ومشروع 111 (D18010) ، ومشروع الفرق المحلية الابتكارية والبحثية لبرنامج مواهب نهر بيرل في قوانغدونغ (2017BT01S155) ، مؤسسه الصين لدكتوراه العلمية (2018M640767).

1. زرع البيض
<ol><li>اعداد الغذاء وجبه الذرة القياسية لزرع البيض. ملاحظه: للحصول علي وصفه والطبخ الاجراء للغذاء وجبه الذرة القياسية المستخدمة هنا ، انظر التفاصيل المنشورة سابقا15.</li>
	<li>اعداد معجون الخميرة الطازجة عن طريق أضافه 6 مل من الماء المقطر إلى 4 غرام من الخميرة المجففة النشطة في أنبوب الطرد المركزي 50 mL. استخدام ملعقة لخلط وجعل عجينه.</li>
	<li>جعل زجاجات وضع البيض عن طريق ملء الطعام وجبه الذرة في الزجاجات ونشر ما يقرب من 1 غرام من عجينه الخميرة علي سطح الطعام الذرة مع ملعقة.</li>
	<li>وضع الذباب من الأنماط الجينية المطلوبة في زجاجه وضع البيض ووضعه في حاضنه مع درجه حرارة ثابته من 25 درجه مئوية والرطوبة من 60 ٪. ملاحظه: الصلبان المثالية تتكون عاده من 150 الذباب البكر وعلي الأقل 75 الذكور. حفظ الذباب في الظلام عن طريق وضع مربع للضوء علي زجاجات وضع البيض سوف تزيد من معدل التكاثر.</li>
	<li>قبل جمع البيض ، واسمحوا الذباب وضع البيض لمده 1 ساعة للسماح لأزاله جميع البيض القديمة التي لا تزال مخزنه في القناات الانثويه.</li>
	<li>السماح الذباب وضع البيض في زجاجه جديده وضع البيض ل 1 ساعة وأزاله البالغين من الزجاجة. ملاحظه: السيطرة علي الوقت وضع البيض للتقليل من نطاق النمو من أجل الحصول علي اليرقات في مرحله تنموية تسيطر عليها بدقه.</li>
	<li>السماح للبيض لتطوير ل 84 h في اليرقات instar الثالثة في الحاضنة في 25 درجه مئوية مع 12 ساعة/12 ساعة الضوء/الظلام دوره.</li>
</ol>2. علاج المجاعة ليرقهات
ملاحظه: كما ذكر أعلاه ، في اليرقات instar الثالثة ، وهناك عدد قليل أو لا توجد قطرات الدهون للكشف في البويضات تحت ظروف التغذية العادية ، ولكن يمكن ان يسبب العديد من قطرات الدهون الكبيرة في البويضات تحت ظروف الإجهاد ، مثل المجاعة. لمزيد من التحقق من هذه الطريقة ، فمن الضروري لعلاج هذه اليرقات للحث علي التكوين الحيوي قطره الدهون في البويضات. هنا ، تم اختيار دوره التجويع الوقت من 12 ح ، 24 ح ، و 36 h كنموذج. وعلي وجه الخصوص ، تكفي فتره قصيرة من المجاعة (3 ساعات علي سبيل المثال) للحث علي قطرات الدهون القابلة للكشف في البويضات. قد تختلف مده التجويع وفقا للأهداف والإعدادات التجريبية المحددة.
<ol><li>جعل غرف للجوع والعلاجات السيطرة.<ol>
<li>لغرف العلاج التجويع: وضع ورقه فلتر من الحجم المناسب في طبق بيتري 6 سم وماصه 1 مل من تلفزيوني علي ورقه فلتر.</li>
		<li>لغرف العلاج السيطرة: مكان 5 مل من بلومنقتون الطعام القياسية الذرة في طبق بيتري.</li>
	</ol>
</li>
	<li>استخدام ملعقة لحفر برفق اعلي الطبقة العليا من المواد الغذائية التي تحتوي علي اليرقات التي لا تزال تحفر في الطعام ونقلها إلى طبق بيتري مليئه 5 مل من تلفزيوني. يحرك اليرقات برفق في البرامج التلفزيونية لأزاله اي تلوث غذائي من اليرقات وجعلها نظيفه قدر الإمكان.</li>
	<li>استخدام فرشاه صغيره لجمع 40 اليرقات instar الثالثة من نفس الحجم التقريبي. فرزها عشوائيا في التجويع أو غرفه التحكم ، مع 20 اليرقات لكل منهما.</li>
	<li>وضع الغرف في الحاضنة في 25 درجه مئوية مع الرطوبة 60 ٪ والسماح للتنمية لمده 12 ساعة ، 24 ساعة ، و 36 h من العلاج. ملاحظه: ليرقات في غرفه التجويع ، أضافه 1 مل من تلفزيوني كل 12 ساعة لتجنب الجفاف اليرقات.</li>
</ol>3. تشريح البويضات
<ol><li>استخدام فرشاه صغيره لاختيار اليرقات من العمر المناسب (12 ساعة ، 24 ساعة ، أو 36 h بعد العلاج) ، ثم نقلها إلى طبق بيتري جديده مليئه 5 مل من الجليد الباردة لغسل. ملاحظه: كرر الخطوة 2.2 عند التعامل مع اليرقات في غرفه التحكم لأزاله اي تلوث غذائي.</li>
	<li>ملء لوحه تشريح مع الجليد الباردة تلفزيوني واستخدام ملقط لنقل اليرقات بلطف في لوحه تشريح. وضع لوحه تشريح تحت المجهر ستيريو لخطوه تشريح التالية. ملاحظه: وسوف تساعد درجه الحرارة الباردة الجليد الحركات البطيءه لليرقات وتسهيل تشريح.</li>
	<li>تحويل اليرقات الجانب البطني صعودا والجانب الظهري لأسفل وعقد بلطف في مكان باستخدام ملقط. تامين اليرقات إلى صفيحه التشريح عن طريق وضع دبوس تشريح علي الرغم من البلعوم في الطرف الامامي ودبوس آخر من خلال الساكل في النهاية الخلفية. ملاحظه: يتم تحديد الجانب الظهري بسهوله أكبر بوجود جذوع ظهريه من القصبة الهوائية.</li>
	<li>استخدمي مقص الربيع من فأناس لشق (طوليا) من خلال البشرة من الامام إلى النهاية الخلفية.</li>
	<li>أزاله النسيج الداخلي للبشرة باستخدام ملقط. ملاحظه: يجب توخي الحذر عند أزاله فروع الرغامي لتجنب الاضرار التي لحقت بالبويضات ، والتي يتم ترجمتها في السطح الداخلي للبشرة.</li>
	<li>مع ملقط ، واسترداد دبابيس تشريح ونقل البشرة إلى 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي مليئه بخدمات تلفزيونيه علي الجليد.</li>
	<li>الاستمرار في تشريح اليرقات الأخرى باتباع الاجراء الموصوف أعلاه.</li>
</ol>4. تلطيخ الدهون قطره
<ol><li>احتضان البشرة تشريح في التلميع التثبيت لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) علي المدورة. ملاحظه: يحتوي المخزن المؤقت للتثبيت علي 4% بارافورمالدهيد (PFA) في الاذاعه التلفزيونية.</li>
	<li>قم بازاله المخزن المؤقت للتثبيت ، متبوعا بالغسيل السريع. لاجراء غسل سريع ، أضافه 1 مل من تلفزيوني في RT في الأنبوب بعد أزاله PFA ، بلطف أعاده تعليق الانسجه ، وتجاهل تلفزيوني. تحذير: يحتوي المخزن المؤقت للتثبيت علي PFA ، والذي يضر بصحة الإنسان. من المهم التخلص بشكل صحيح من المخزن المؤقت للتثبيت كنفايات خطره.</li>
	<li>غسل العينات 3x لمده 5 دقائق لكل منها مع تلفزيوني لغسل جميع بقايا PFA المحتملة.</li>
	<li>احتضان البشرة مع BODIPY 493/503 (1 ميكروغرام/مل ؛ انظر جدول المواد) لمده 30 دقيقه في RT علي المدورة. ملاحظه: من هذه الخطوة فصاعدا ، التفاف أنبوب الطرد المركزي مع قطعه من رقائق ألومنيوم لحماية عينات من الضوء وتقليل ممكن الصورة التبييض.</li>
	<li>أزاله الحل تلطيخ BODIPY 493/503 وغسل عينات 3x لمده 10 دقيقه لكل منها مع تلفزيوني لأزاله الاصباغ المتبقية تماما.</li>
</ol>5. التركيب والتصوير
<ol><li>ضع 6 μL من الوسط المتصاعد علي شريحة المجهر النظيفة. ملاحظه: يتم استخدام متوسط التركيب لوقت الكشف الأطول استنادا إلى خصائصه المضادة للتلاشي.</li>
	<li>استخدام ملقط للتقاط البشرة واحده وأزاله بلطف المتبقية تلفزيوني مع مسح.</li>
	<li>ضع البشرة في الوسط المتصاعد واضبط اتجاهها بحيث يكون سطحها الداخلي الذي يحتوي علي البويضات في القاع ويكون سطحها الخارجي علي القمه.</li>
	<li>ضعي الشفة علي البشرة برفق. ملاحظه: أزاله اي المتوسطة الاضافيه المتصاعدة تسرب من تحت الشفة مع مسح ، إذا لزم الأمر. لتسهيل التصوير ، قم بالضغط برفق علي المشبك مع ملقط بحيث انه عند مراقبه الشريحة من خلال المجهر ، يمكن ان تكون كتله البويضة بسهوله في مستوي واحد. بدلا من ذلك ، فانه من الممكن عمليا لخفض البشرة إلى اثنين من البشرة النصف من خلال الخط الأوسط لتجنب المتداول الأعلى من البشرة الكاملة عند تركيب الانسجه.</li>
	<li>تطبيق تلميع الأظافر واضحة حول حواف كوفيرسليب لختم.</li>
	<li>وضع الشرائح في مربع عينه للضوء والسماح لطلاء الأظافر لتجف في RT ، والتي قد يستغرق 5-10 دقيقه.</li>
	<li>المضي قدما في التحليل المجهري. التقاط الصور باستخدام المجهر البؤري (التكبير 63x مع إعدادات تصفيه GFP أو FITC الأمثل ، والاثاره = 488 nm ، والانبعاثات = 503 nm) للحصول علي إشارات نظيفه وحساسة مع خلفيه مصغره.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+research+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li>
<li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+and+Drosophila+models+to+investigate+the+mechanistic+links+between+diet%2C+obesity%2C+type+II+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).</li>
<li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).</li>
<li>Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+functions+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The development and functions of oenocytes.</a> Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+suppresses+age-dependent+ectopic+fat+accumulation+by+maintaining+the+proteostasis+of+PLIN2+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila.</a> Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+lipid+droplet+turnover+in+response+to+nutrient+deprivation+via+p62-mediated+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).</li>
<li>Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets%3A+from+archaea+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li>
<li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li>
<li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).</li>
<li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li>
<li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
</ol>

وليس لدي صاحبي البلاغ اي تضارب في المصالح للكشف عنه.

ومن بين الخطوات المذكورة أعلاه ، هناك عده خطوات حاسمه في هذا البروتوكول ، حيث ان فتره وضع البيضة هي واحده من هذه. كنسيج تعبئة الدهون ، والبويضة حساسة للغاية لحاله التغذية6،8. قد تؤدي الفترات الزمنيه المطولة لوضع البيض إلى يرقات اليد وزيادة المنافسة الغذائية ، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقه. تسمح الفترة الزمنيه التي وضعها البيض والتي تستخدم في هذا البروتوكول بان تتطور اليرقات بدون منافسه غذائية. وهناك عدد أكبر بكثير من اليرقات التي يمكن ان تنجم عن فترات زمنيه أطول ل...

الدهون ضرورية لبقاء الخلية. بالاضافه إلى دورها التقليدي كمكونات لا تتجزا من أنظمه الغشاء الخلوي ، تلعب الدهون أيضا وظائف حاسمه في إمدادات الطاقة والإشارات المحولة طوال دوره حياه الإنسان الفردية1. وهكذا, استقلاب الدهون يجب ان تتوافق مع اللوائح الصارمة للحفاظ علي الأرقاء الفسيولوجية في الخلايا. ومن المعروف ان تقلبات نتائج استقلاب الدهون في مختلف الامراض ، مثل مرض السكري والكبد الدهني. علي الرغم من الاهميه الكبيرة لاستقلاب الدهون في صحة الحيوانية ، تبقي أليات الاساسيه لتنظيم استقلاب الدهون غير معروفه إلى حد كبير.
وقد استخدمت دروفيا علي نطاق واسع لسنوات منذ بدا البروفيسور توماس h. مورغان استخدامها في الدراسات التي تنطوي علي علم الوراثة وغيرها من المسائل البيولوجية الاساسيه2. في العقود القليلة الماضية ، أظهرت الادله الناشئة ان دروفيسيلا هو كائن نموذجي ممتاز في دراسة العديد من الامراض المرتبطة باستقلاب الدهون ، مثل السمنة1،3. وعلي وجه الخصوص ، تشارك دروفويلا الجينات الايضيه المحفوظة بشكل كبير مع البشر وتمتلك الانسجه/الأعضاء ذات الصلة المتشابهة وأنواع الخلايا لاستقلاب الدهون.
علي سبيل المثال ، فان الجسم الدهون من دروفيسيلا، والتي هي المسؤولة عن التخزين triacylglyceride ، وظائف مماثله للانسجه الدهنية البشرية. في الاونه الاخيره ، وقد تبين ان مجموعه من خلايا الكبد مثل المتخصصة (اي البويضات) ، والتي تم الإبلاغ عن ان تكون تناظريه وظيفية للكبد البشري ، ان تشارك في الأحماض الدهنية والأيض الهيدروكربون في الذباب الفاكهة4،5. وعلي غرار الحالة في كبد الثدييات ، تستجيب البويضات للجوع عن طريق تنشيط تشكيل القطيرات الدهنية في كل من اليرقات والبالغين ، مما يؤدي إلى تراكم الدهونفي الكريات4و6و7و8. وبشكل تشريحي ، يتم ربط البويضات باحكام بالسطح الداخلي القاعدي للبشرة الجانبية في مجموعات من ست خلايا تقريبا لكل هيميسيجمينت بطني ، مما يجعل من المتعذر عزل مجموعات البويضات من البشرة. التالي ، يجب ان تكون مرتبطة البويضات إلى البشرة اثناء تشريح وتلطيخ.
يتم تخزين الدهون في شكل قطرات الدهون ، والتي هي العضيات مع اغشيه طبقه واحده في الخلايا9. توجد قطرات الدهون في جميع أنواع الخلايا تقريبا عبر الأنواع المختلفة10. وتتغير ديناميات القطيرات الدهنية ، بما في ذلك حجمها وعددها ، استجابه للضغوط البيئية. ويعتبر هذا انعكاسا للوضع الأيضي في الاستجابة للإجهاد, مثل الشيخوخة والمجاعة7,8. ولذلك ، فانه من الاهميه بمكان تطوير طريقه ممكنة وموثوقه لتحديد نوعيا ديناميات قطره الدهون في البويضات اثناء التنمية وتحت ظروف عصيبة. علي وجه الخصوص ، في اليرقات instar الثالثة ، البويضات تحتوي علي عدد قليل أو لا توجد قطرات الدهون للكشف تحت ظروف التغذية ، لكنها تحتوي علي العديد من قطرات الدهون الكبيرة بعد الحرمان من التغذية4. للتحقق من فعاليه هذه الطريقة ، فمن المقترح لتنفيذ تلطيخ قطره الدهون في البويضات تحت ظروف الجوع.
حاليا ، تتوفر العديد من الاصباغ الدهنية لتلطيخ قطرات الدهون ، مثل الاصباغ غير الفلورية السودان الأسود والنفط الأحمر O والاصباغ الفلورية النيل الأحمر و BODIPY 493/50311. السودان الأسود والنفط الأحمر O تستخدم عاده لاسترات الانسجه الكولسترول و triacylغليجليولس ويمكن الكشف عنها بسهوله عن طريق المجهر الضوئي. ومع ذلك ، فان الخلفية العالية نسبيا والدقة المنخفضة نسبيا هما العاملان المقيدين لتطبيقاتها في التحليل النوعي لديناميكيات القطيرات الدهنية. للتغلب علي القيود المفروضة علي الاصباغ غير الفلورية ، يتم استخدام النيل الأحمر و BODIPY 493/503 كبدائل مثاليه لتلطيخ الدهون قطره. وقد أفيد ان النيل الأحمر يمكن أيضا الكشف عن بعض الكوليسترول غير القابل للاستيفيد ، مما يجعل bodipy 493/503 صبغه أكثر تحديدا لقطرات الدهون الخلوية ، إلى حد ما12،13،14.
قبل كل شيء ، لتلبيه الحاجة إلى تحليل سريع وحساس لقطرات الدهون في البويضات ، وهذا البروتوكول يقدم وسيله ممكنة وقابله للتكرار للغاية من تلطيخ الدهون القائم علي التثبيت باستخدام BODIPY 493/503 كصبغه وصمه عار. في هذا التقرير ، يتم تشريح البويضات ، ويستخدم BODIPY 493/503 لتلطيخ قطره الدهون في البويضات ، والتي يتم الكشف عن قطرات الدهون عن طريق المجهر البؤري. سهوله والقدرة علي التحمل من هذا الاجراء يجعلها مثاليه للتعديل ومزيد من الاستخدام في التطبيقات الأخرى ، مثل تدفق الخلوي.

<table><tbody><tr><td>50 مل أنبوب الطرد المركزي</td><td>كورنينج</td><td></td><td>430829 50 مل</td></tr><tr><td>6 سم طبق بتري</td><td>ثيرمو فيشر</td><td>150326</td><td>6 سم</td></tr><tr><td>أجار</td><td></td><td></td><td>للأغذية الذبابية</td></tr><tr><td>رقائق الألومنيوم</td><td>N / A</td><td>N /</td><td>A حماية الخنقيرة من الضوء</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>صبغة تلطيخ قطرات الدهون</td></tr><tr><td>مجهر</td> <td>متحد البؤرLeica</td><td>Leica TSC SP5</td><td>شراب الذرة للتصوير</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> المتحد البؤر <td>لأغذية الذباب</td></tr><tr><td>دقيق</td><td></td><td></td> الذرة <td>لأغذية الذباب</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 & مرات 20 مم ، 0.13-0.17 سميكة</td></tr><tr><td>دبوس تشريح</td><td>N / A N / A</td> N <td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>لوحة</td> تشريح <td>N / A</td><td>N</td><td></td></tr><tr>/ A ورق<td>ترشيح</td><td>N / A</td><td>قطر N / A</td><td>: 11 سم</td></tr><tr><td>عازلة التثبيت</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x PBS</td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td> <td># 5</td></tr><tr><td>حاضنة</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>لثقافة الذبابة</td></tr><tr><td>أنبوب الطرد المركزي</td><td>الدقيق Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 مل</td></tr><tr><td>شريحة الفحص المجهري</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>تركيب متوسط</td><td>VECTASHIELDتركيب تركيب متوسط</td><td>H-1000</td><td>مضاد للبهتان تركيب متوسط</td></tr><tr><td>طلاء الأظافر</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>ختم غطاء</td></tr><tr><td>فرشاة الرسم</td><td>N / A</td><td>N /</td><td></td></tr> A <tr><td>PBS</td><td>N / A</td><td>N / A 1x</td><td>PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي مولار KCl ، 10 ملي أمبير Na 2HPO4 ، 1.8 ملي متر K<H>2PO4 ، درجة الحموضة 7.4)</td></tr> <tr>أدوات <td>مختبر Kylin-Bell</td> <td>المدورة</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>مقص</td><td>Smartdata Medical</td><td>SR81</td><td>Vannas مقص الربيع</td></tr><tr><td>دقيق</td><td></td><td></td> الصويا <td>لطعام الذباب</td></tr><tr><td>ملعقة</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>طعام دقيق الذرة</td><td>القياسي N / A</td><td>N / A</td><td>الترميز إلى وصفة طعام دقيق الذرة القياسية بلومنجتون</td></tr><tr><td>ستيريو المجهر</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>لتشريح الأنسجة</td></tr><tr><td>مسح الورق</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>خميرة</td><td></td><td></td><td>لطعام الذباب</td></tr><tr><td></td><td>YW يتم الاحتفاظ بها كمخزون مختبر</td><td>N / A</td><td>ذبابة الفاكهة</td></tr></tbody></table>

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

الدهون ضرورية للتنمية الحيوانية والتوازن الفسيولوجي. خلل التمثيل الغذائي للدهون النتائج في مختلف العيوب التنموية والامراض ، مثل السمنة والكبد الدهني. عاده ، يتم تخزين الدهون في قطرات الدهون ، والتي هي متعددة الوظائف الدهنية تخزين الدهون في الخلايا. قطرات الدهون تختلف في الحجم والعدد في الانسجه المختلفة وتحت ظروف مختلفه. وقد أفادت التقارير بان قطرات الدهون يتم التحكم فيها باحكام من خلال تنظيم تكوينها الإحيائي وتدهورها. في دروفوسيلا، البويضة هي نسيج مهم لاستقلاب الدهون وتم التعرف عليها مؤخرا كالتناظرية الكبد البشرية فيما يتعلق بتعبئة الدهون استجابه للإجهاد. ومع ذلك ، فان أليات التي تقوم علي تنظيم الأيض قطره الدهون في البويضات لا تزال بعيده المنال. لحل هذه المشكلة ، فمن المهم للغاية لتطوير طريقه موثوقه وحساسة لتصور مباشره التغيرات الحيوية قطره الدهون في البويضات اثناء التنمية وتحت ظروف عصيبة. الاستفادة من 493/503 bodipy محبه للدهون ، صبغه فلورية قطره الدهون المحددة ، الموصوفة هنا هو بروتوكول مفصل لتشريح والدهون اللاحقة قطره الدهن في البويضات من اليرقات دروفيسيلا ردا علي المجاعة. وهذا يسمح للتحليل النوعي لديناميات القطيرات الدهنية في ظل ظروف مختلفه عن طريق المجهر البؤري. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة السريعة والقابلة للتكرار للغاية في الشاشات الجينية للعوامل الوراثية الجديدة التي تنطوي علي استقلاب قطره الدهن في البويضات والانسجه الأخرى.

التنفيذ الناجح لهذا الاجراء يجب ان يؤدي إلى تلطيخ الدهون واضحة التي تكشف عن عدد وحجم قطرات الدهون في البويضات. يبين الشكل 1ا ، ا ' ، ا '' ان هناك عدد قليل من قطرات الدهن القابلة للكشف (النقاط الخضراء) في البويضات من يرقات التغذية العادية خلال مراحل النمو المختلفة. الشكل 1ب ، ب ' ، ب '' يظهر زيادة قطرات الدهون (النقاط الخضراء) كميه في البويضات استجابه ل 12 h (b) ، 24 h (b ') ، و 36 h (b '''') فترا...

وترد هنا طرق مفصله لتشريح وتلطيخ الدهون قطره من البويضات في اليرقات دروفيه باستخدام BODIPY 493/503 ، صبغه فلورية الدهون الخاصة الحبريه.

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

يمكن استخدام هذه الطريقة من تشريح oenocyte وتلطيخ قطرات الدهون لتحقيق ظهور قطرات الدهون في يرقات الدوزوفيا oenocyte في ظل الظروف العادية والمجهدة. توفر هذه الطريقة أداة مفيدة لدراسة استقلاب الدهون ليس فقط في الحشرات ولكن أيضًا في الثدييات مع بعض التعديلات الطفيفة فقط. للحث على وضع البيض، ضع 150 ذباب أنثى عذراء و75 ذكراً من الأنماط الجينية المطلوبة في زجاجة زرع البيض ووضع الزجاجة تحت صندوق مقاوم للضوء في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪.بعد ساعة واحدة، نقل الذباب إلى زجاجة جديدة والسماح للذباب وضع البيض في زجاجة جديدة لمدة ساعة واحدة قبل إزالة الكبار. ثم، السماح للبيض أن تتطور إلى اليرقات النجمية الثالثة لمدة 84 ساعة في 25 درجة سيلسيوس مع دورة 12 ساعة ضوء الظلام. قبل البدء في علاج المجاعة ، ضع قطعة بحجم مناسب من ورق التصفية في طبق بيتري ستة سنتيمتر وأضف ملليلترًا واحدًا من PBS على الورق لإنشاء غرفة تجويع.لجعل غرفة معالجة التحكم، ضع خمسة ملليلترات من طعام دقيق الذرة القياسي بلومينغتون في طبق بيتري ستة سنتيمترات. عندما تكون الغرف جاهزة ، استخدم فرشاة طلاء صغيرة لجمع يرقات النجوم من نفس الحجم التقريبي من زجاجة وضع البيض. و 20 يرقة بشكل عشوائي في كل تجويع وغرفة التحكم.ثم ضع الغرف في الحاضنة لمدة 12 أو 24 أو 36 ساعة من التطوير و / أو المجاعة. في نهاية فترة العلاج ، استخدم ملقط لنقل اليرقات بلطف من كل غرفة إلى لوحة تشريح تحتوي على PBS بارد جليدي ووضع اللوحة تحت مجهر ستيريو. توجيه أول جانب البطن اليرقة حتى واستخدام ملقط لعقد بلطف اليرقة في مكان.ضع دبوسًا واحدًا من خلال البلعوم ودبوسًا آخر من خلال الـpiracle لتأمين اليرقة إلى الطبق. استخدام مقص الربيع Vannas لجعل شق طولي من خلال البشرة من الجزء الأمامي إلى الطرف الخلفي من الحيوان. استخدام ملقط لإزالة الأنسجة الداخلية للبشرة، مع الحرص على تجنب تلف oenocytes على السطح الداخلي للبشرة.ثم استخدام ملقط لاسترداد دبابيس تشريح ونقل البشرة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني على الجليد. لطخة قطرات الدهون، احتضان البشرة تشريح في العازلة التثبيت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار، تليها resuspension سريع في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم غسل العينات مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل لإزالة أي تثبيت المتبقية.بعد الغسيل الأخير، قم باحتضان عينات البشرة بمسبار دهني مناسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار. أثناء الحضانة، قم بلف الأنابيب العينة في احباط لحماية الأنسجة من الضوء وغسل العينات ثلاث مرات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل. لتصوير oenocytes، نقل كل عينة البشرة إلى ستة ميكرولترات من المتوسطة تصاعد على شريحة المجهر نظيفة، وضبط اتجاه الأنسجة، بحيث السطح الداخلي الذي يحتوي على oenocytes لمس الجزء السفلي من الشريحة.ضع غطاءً برفق على البشرة وختم الحواف بتلميع الأظافر الواضح. عندما جفف البولندية، صورة العينات على المجهر confocal، وضع التكبير 63 X مع الإثارة المناسبة وأطوال موجية الانبعاثات. هناك عدد قليل من قطرات الدهون التي يمكن اكتشافها داخل oenocytes من يرقات التغذية العادية في مراحل النمو المختلفة.كما لوحظ في هذه الصور التمثيلية ومع ذلك، فإن قطرات الدهون زيادة في عدد داخل oenocytes استجابة ل12، 24، و 36 ساعة من المجاعة فترات. توفر هذه الطريقة بروتوكولاً سهلاً ومجدياً للباحثين في مجالات البحث ذات الصلة للتحقيق فيما إذا كانت التلاعبات الجينية أو البيئية تسبب تغييرات في قطرات الدهون في الخلايا.

dissection-lipid-droplet-staining-oenocytes-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في الحشرات ، وإنتاج مركبات الهيدروكربونية oenocytes جليدية. هذه المركبات تحمي من الجفاف وتسهيل الاتصالات الكيميائية. هنا نظهر تقنية التشريح المستخدمة لعزل oenocytes من...

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

كيف محاريب والخلايا الجذعية خلال نموذج التنمية هو السؤال المهم مع الآثار العملية.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

وحيد ذبابة الفاكهة Ommatidium تشريح والتصوير

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

يوضح هذا الفيديو تلطيخ قطرات الدهون في ذبابة الفاكهة الخلايا اليرقاتية - الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية - باستخدام صبغة BODIPY الفلورية المحبة للدهون. تعمل هذه الخلايا كنموذج لدراسة التمثيل الغذائي للدهون أثناء التطور واستجابة للإجهاد البيئي مثل الجوع.

تلطيخ قطرات الدهون لخلايا ذبابة الفاكهة اليرقات: تقنية لتقييم تراكم قطرات الدهون في ظل الظروف الطبيعية والمجهدة باستخدام صبغة قائمة على BODIPY

Immunostaining هي تقنية فعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا والبروتينات داخل الأنسجة. من خلال استخدام الصوتنة ، يخفف البروتوكول الموصوف هنا من الحاجة إلى تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة السوداء من الأجنة واليرقات في المرحلة المتأخرة قبل تلطيخ المناعة. نحن نقدم منهجية فعالة للتلوين المناعي لليرقات الكاملة المثبتة بالفورمالديهايد.

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em

ذبابة الفاكهة والنظم المكونة للدم الثدييات تشترك في العديد من السمات المشتركة، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا الجيني لدراسة تكون الدم. نحن هنا لشرح تشريح والتركيب من الجهاز المكونة للدم اليرقات كبيرا لالمناعية. وصفنا أيضا أساليب لفحص مختلف الأجزاء المكونة للدم اليرقات بما في ذلك تعميم hemocytes وخلايا الكريستال اطئة.

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

&lt; p class = 'jove_content'&gt; تحليل العلاقة بين بنية الميتوكوندريا ووظيفة مطلوب لفهم شامل للآليات التنظيمية لوظائف الميتوكوندريا. تم وصف طرق محددة لدراسة بنية الميتوكوندريا ووظيفتها في ذبابة الفاكهة الحية والثابتة المبايض وعرضها في هذه الورقة.

دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في ذبابة الفاكهة المبايض

والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض الخوادر.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

في جنين ذبابة الفاكهة المبكر ، تكون العديد من العضيات متحركة. من حيث المبدأ ، يمكن تصويرها مباشرة عبر تحقيقات فلورسنت محددة ، لكن قشر البيض يمنع التطبيق المباشر على الجنين. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مثل هذه المجسات عن طريق الحقن المجهري ، ثم تحليل حركة العضيات السائبة عبر قياس سرعة صورة الجسيمات.

تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة

تعلم تشريح الخلايا الزيتية وتلطيخ الدهون القطرة في يرقات ذبابة الفاكهة باستخدام صبغة BODIPY 493/503. تتيح هذه الطريقة دراسة استقلاب الدهون في الحشرات والثدييات.

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

استكشف المزيد من الفيديوهات