الجمع بين الليزر التقاط Microdissection وMicrofluidic qPCR لتحليل الملامح النسخية للخلايا المفردة: نهج بيولوجيا النظم للاعتماد على المواد الأفيونية

هذه طريقة دقيقة للغاية وفعالة من حيث التكلفة لفهم التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن تناسب 96 عينة في دفعة واحدة. هذا العدد الكبير من العينات يسمح لنا بتحديد الأنواع الفرعية الخلوية مع خصوصية التشريح.

ويمكن تطبيق خط أنابيب هذه الطريقة إلى أي مشكلة بيولوجية، أي نظام، أي نسيج، من أجل الاستفسار عن استجابة الخلوية الفردية من الخلايا العصبية الفردية أو أنواع الخلايا الأخرى للمرض أو أي اضطراب آخر، أي وظيفة. ثم تذهب إلى أبعد من ذلك والاستفسار عما إذا كانت ردود الخلية هذه لها بنية تشريحية. إزالة الدماغ من مربع جمع الأنسجة ومكان على تشاك cryostat.

جمع 10 أجزاء ميكرون تحتوي على النواة المركزية من اللوزة أو غيرها من منطقة الدماغ المفضلة عن طريق ذوبان تصاعد 10 أجزاء ميكرون على شرائح الزجاج العادي. ضع الشرائح الزجاجية على الفور على مقلاة معدنية تستريح على الجليد الجاف. وضع الشرائح مع أقسام الدماغ في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.

لأداء سلسلة الإيثانول والزيلين الجفاف، تراجع أولا الشرائح في 75٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. بعد ذلك مباشرة، تراجع الشرائح في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. ثم تراجع الشرائح في 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية.

وأخيرا، تراجع الشرائح مباشرة في حاوية ثانية من 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. بعد سلسلة الجفاف الإيثانول، تراجع الشرائح في إكسيلين سكب حديثا لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك مباشرة، غمس الشرائح في حاوية ثانية من الزيلين لمدة أربع دقائق قبل التجفيف كما هو موضح في بروتوكول النص.

استخدام الفلوريسنس لتحديد نوع الخلية الملطخة ونواتها في المنطقة ذات الاهتمام. اختر خلية واحدة أو عدة خلايا إذا كان القيام بعيّنات تجمعها خلايا مفردة. وضع علامة على الخلايا ذات الأهمية باستخدام التقاط الليزر microdissection أو برنامج LCM.

ضع غطاء LCM فوق الشريحة على المنطقة ذات الأهمية واذاب لاصقة غطاء LCM على مساحة الخلية المفردة المحددة كما هو موضح في بروتوكول النص. حدد الخلايا الفردية التي سيتم تجميعها للتحليل باستخدام أدوات برامج LCM. يجب أن تكون الخلايا المختارة في المنطقة التشريحية للنواة المركزية لللوزة على أساس أطلس دماغ الفئران وال bregma.

يجب أن تكون الخلايا على الأقل ثلاثة ميكرون من النوى الملطخة المجاورة. ثم اطلاق الليزر الأشعة تحت الحمراء لجمع الخلايا الفردية التي تم التعرف عليها. ضع الغطاء في محطة مراقبة الجودة وعرضه لضمان اختيار الخلايا المرغوبة فقط.

إذا تم اختيار الخلايا الأخرى عن طريق الخطأ، يمكن استخدام ليزر فوق البنفسجية لتدمير الخلايا غير المرغوب فيها في حين أن الغطاء لا يزال في محطة QC. التقاط صورة لقسم الأنسجة من حيث تم جمع الخلية لتوثيق خصوصيتها التشريحية. تسجيل المسافة من شريحة من bregma إذا كان ذلك مناسبا باستخدام أطلس الدماغ الفئران كمرجع.

إزالة غطاء LCM من محطة مراقبة الجودة وإرفاق جهاز استخراج العينة. ثم ماص 5.5 ميكرولترات من عازلة تحلل على العينة. تناسب جهاز الاستخراج على أنبوب microcentuge 0.5 ملليلتر ووضعها على لوحة ساخنة في 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

تدور أسفل العينة وتحلل العازلة لمدة 30 ثانية بسرعة منخفضة ووضع العينة التي تم جمعها في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. لتنفيذ ما قبل التضخيم من مرنا خلية واحدة لشريحة صفيف ديناميكية، أولا إضافة خمسة ميكرولترات من 5X VILO إلى كل بئر من جديد 96 من 96 لوحة PCR. إزالة عينات خلية واحدة LCM من ناقص 80 درجة مئوية والسماح لهم ذوبان لفترة وجيزة.

بعد الطرد المركزي بسرعة منخفضة، إضافة 5.5 ميكرولترات من عينات خلية واحدة lysed إلى لوحة PCR إضافة كل عينة إلى بئر الخاصة بها. ضع لوحة PCR مع العينات و VILO في الدراجات الحرارية والحرارة عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة دقيقة ونصف. ثم تدور لوحة لمدة دقيقة واحدة في 1، 300 مرات ز وأربع درجات مئوية ووضع لوحة على الجليد.

إضافة 10X التوليف التوليفية مزيج سيد، T4 جين 32 البروتين، والحمض النووي العازلة للتعليق إلى كل بئر. ضع لوحة PCR التي هي لوحة عينة واحدة في ثيرموستر وتشغيل كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد الدورة، إضافة تسعة ميكروليترس من محلول طق البوليميراز لكل بئر في لوحة PCR 96-well.

تسعة ميكروليتر تتكون من 7.5 ميكرولترات من طق البوليميراز مزيج الماجستير و 1.5 ميكرولترات من تجمع التمهيدي. الآن، ضع لوحة PCR في ثيرموستر وتشغيل برنامج ما قبل التضخيم مفصلة في بروتوكول النص. بعد بروتوكول ما قبل التضخيم، إضافة ستة ميكرولترات من حل exonuclease إلى كل بئر في لوحة PCR 96 جيدا.

يتكون الحل exonuclease من 0.6 ميكرولترات من 10X exonuclease واحد العازلة رد فعل، 1.2 ميكرولترات من exonuclease واحد، و 4.2 ميكرولترات من العازلة تعليق الحمض النووي. ضع لوحة PCR في الدراجات الحرارية وتشغيل البرنامج المذكور في بروتوكول النص. وأخيرا، إضافة 54 ميكرولترات من المخزن المؤقت TE إلى كل بئر من لوحة عينة واحدة.

تدور لوحة PCR في 1, 300 مرات ز لمدة خمس دقائق. تخزين في أربع درجات مئوية إذا استمر على الفور إلى الخطوة التالية. في لوحة PCR 96-well الجديدة التي هي لوحة عينة اثنين، إضافة خمسة microliters من صبغة الحمض النووي ملزمة ومحلول مزيج ماجستير.

إضافة ثلاثة ميكرولترات من عينات ما قبل تضخيمها من لوحة عينة واحدة في الآبار المقابلة في لوحة العينة اثنين. تدور لوحة PCR في 1، 300 مرة ز ومن ثم وضع لوحة على الجليد. في لوحة PCR 96-well جديدة وهي لوحة المقايسة اثنين، إضافة خمسة ميكرولترات من محلول تحميل المقايسة لكل بئر.

يتكون محلول تحميل المقايسة من 3.75 ميكرولترات من كاشف التحميل 2X GE و 1.25 ميكرولترات من مخزن التعليق DNA لكل بئر. ثم إضافة 2.5 microliters من 10 التمهيدي qPCR micromolar من لوحة المقايسة واحد إلى المقابلة جيدا في لوحة المقايسة اثنين. تدور لوحة PCR في 1, 300 مرات ز لمدة خمس دقائق.

لتحميل وتشغيل شريحة الصفيف الديناميكية، قم أولاً بتعبئة الشريحة باستخدام سائل خط التحكم. ثم ضع الشريحة في وحدة تحكم HX لوحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية وقم بتشغيل البرنامج النصي 136X الرئيسي. إضافة ستة ميكروليتر من لوحة عينة اثنين في آبار العينة المقابلة في رقاقة الصفيف الديناميكي 96 في 96.

الآن، إضافة ستة microliters من لوحة المقايسة اثنين في آبار المقايسة المقابلة في 96 من قبل 96 رقاقة صفيف ديناميكية. استخدام الإبر لموسيقى البوب أي فقاعات الهواء في الآبار من 96 من قبل 96 شريحة صفيف ديناميكية. ثم ضع الرقاقة في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية HX وقم بتشغيل برنامج 136X لمزيج التحميل.

بعد ذلك، قم بإزالة الشريحة من وحدة تحكم HX في مؤسسة التمويل الدولية. ضع شريحة الصفيف الديناميكي 96 في 96 في منصة RT-qPCR microfluidic وتشغيل بروتوكول جنرال إلكتريك السريع 96 في 96 PCR. تم التحقق من اختيار الخلايا الفردية بصريا وجزيئيا. بصريا، تم عرض مورفولوجيا الخلوية قبل جمع الخلايا.

تظهر هنا صور تمثيلية لشريحة مع فئران مُخْتَكِرة تحتوي على النواة المركزية للـ amygdala. تظهر الصور اللاحقة اختيار الخلايا المفردة وإزالتها من الأنسجة لتحليلها. جزيئياً، علامات نوع الخلية المحددة أظهرت زيادة التعبير في نوع الخلية الخاصة بها.

على وجه التحديد، لوحظ زيادة التعبير عن نيون في الخلايا العصبية، ماف في microglia، وGfap في الخلايا الفلكية. تُظهر الخريطة الحرارية التعبير عن جميع العينات عبر 40 جينًا مُسَرَسَاً. الصفوف هي عينات مجمعة الشد، والأرقام تدل على مجموعات العينة والأعمدة هي الجينات.

تُظهر أساليب التحليل متعددة المتغيرات أن الخلايا الفلكية في مجموعة الانسحاب كانت أكثر أنواع الخلايا تأثراً. استناداً إلى هذه البيانات في سياق دراسات أخرى، من المرجح أن تلعب الخلايا الفلكية دورًا رئيسيًا في الالتهاب في النواة المركزية لللوزة أثناء انسحاب المواد الأفيونية. أهم شيء أن نتذكر عن هذه التقنية هو استخدام الأنابيب المناسبة للحد من عدد من فقاعات الهواء.

يمكن التحقق من صحة النتائج النسخية من هذه التجارب باستخدام أساليب قياس البروتين مثل الفلوروسين أو البقعة الغربية على نفس النسيج.