استخدام غشاء Chorioallantoic الدجاج في نموذج Vivo لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية

ويمكن استخدام engraftment من الأورام على الغشاء الكوراليالنتويكي الدجاج، أو CAM، لدراسات الأورام، وفعالية العلاج أو عبر الخلوية. هذه الطريقة تسمح فعالة من حيث التكلفة نمو الورم السريع في المُناعته للمناعة في وضع الجسم الحي. باستخدام نموذج CAM، يمكن اختبار الأساليب العلاجية الجديدة بسرعة باستخدام خطوط الخلايا أو حتى عينات الورم المريض.

الجوانب الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي ضمان تشكيل CAM السليم وعدم تعطيل CAM أو الأوعية الدموية أثناء فتح البيض. في يوم النمو سبعة أو ثمانية عندما تم تطوير CAM بالكامل، إيقاف دوار البيض ووضع ما يقرب من واحد إلى ثلاث بيضات في رف البيض في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. مع إطفاء الأنوار ، ضع شمعة بيض ضد قشرة البيض لتحديد وتحديد موقع خلية الهواء لبيضة واحدة ، ثم تحريك شمعة البيض فوق القشرة للعثور على شبكة كبيرة من الأوعية الدموية ، وتناوب البيضة حسب الضرورة.

سوف تتفرع الأوعية الدموية المثالي بالقرب من منتصف البيض. استخدم علامة لتتبع الأوعية الدموية لاستخدامها في الزرع. بعد العودة على ضوء في غطاء محرك السيارة، واستخدام أداة دوارة لاسلكية مزودة حجر طحن كربيد السيليكون لحفر حفرة صغيرة في قذيفة مباشرة فوق مركز الخلية الهوائية.

عندما تم إزالة معظم قذيفة ولكن مع غشاء داخلي أبيض سليمة، حفر ثقب صغير آخر حيث سيتم فتح نافذة الأوعية الدموية كما أظهرت للتو. عندما تكون الحفرة الثانية جاهزة، استخدم إبرة قياس 18 لاختراق الغشاء الداخلي الأبيض بلطف فوق خلية الهواء والأوعية الدموية مع الحرص على أن الغشاء الداخلي الأبيض، ولكن ليس CAM، يتم تعطيله في جميع أنحاء المنطقة المحفورة بأكملها. مع ضوء غطاء محرك السيارة مرة أخرى، استخدم شمعة البيض للتحقق من أن خلية الهواء قد تم نقلها من نهاية البيض إلى المنطقة على الأوعية الدموية.

إذا لزم الأمر، ضع فراغ أنابيب إدراجها في وحدة تحكم ماصة حول ثقب على خلية الهواء الأصلي وتطبيق بلطف شفط في رشقات نارية قصيرة لتحريك خلية الهواء. وضع علامة على الخطوط العريضة للموقع الجديد من خلية الهواء ما يقرب من 0.5 سنتيمتر داخل الحدود CAM الهواء وإصلاح قطعة من التعبئة الشريط فقط كبيرة بما يكفي لتغطية ثقب على خلية الهواء الجديدة. بعد إعداد البيضين الآخرين كما هو موضح للتو ، أعد البيض إلى الحاضنة وفتح أي بيض إضافي للتجربة في مجموعات من واحد إلى ثلاثة كما هو موضح.

عندما تم فتح كل البيض، نقل واحد إلى ثلاث بيضات مع خلايا الهواء المنقولة إلى رف البيض في مجلس الوزراء السلامة الحيوية واستخدام أداة دوارة لاسلكية مزودة عجلة قطع دائرية لقطع خط صغير على حدود الخلية الهوائية تماما من خلال الخلية دون تعطيل كام أو الأوعية الدموية. باستخدام مقص منحني، قطع حول خلية الهواء المتبقية لإنشاء نافذة في قذيفة والتحقق من صلاحية الجنين. سوف الأجنة قابلة للحياة عرض الأوعية الدموية واسعة النطاق، الألبومين واضحة، حركة الجنين، و / أو ضربات القلب مرئية.

في الأجنة غير القابلة للحياة، قد تظهر كام مبهمة مع عدد قليل من الأوعية، إن وجدت، وقد تكون الأجنة صغيرة أو غائبة دون حركة أو نبضات قلب. باستخدام ملقط Semkin، سحب قطع صغيرة من القطن من كرة القطن العقيمة ولطخ بلطف سطح كام من الأجنة قابلة للحياة لإزالة أي الغبار قذيفة والحطام، ثم تغطية فتحة قذيفة مع قطعة ربع من ستة في سبعة سنتيمترات فيلم شفافة خلع الملابس دون لمس CAM وإعادة البيض إلى الحاضنة مع نافذة مفتوحة تواجه. استخدام قطعة من رف البيض، حافة دوار البيض، أو عنصر آخر مناسب لدعم أي البيض التي تبقي المتداول.

لإعداد تعليق الخلايا السرطانية لزرعها، حصاد الخلايا من ثقافة الخلايا السرطانية من الفائدة ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. استلهمت من فوق الطاقة و إعادة ميكانيكيا الخلايا في الوسط المتبقية. ضع تعليق الخلية على الجليد واستخدم ماصة لقياس حجم الخلايا في المتوسط.

ثم إعادة تركيز الخلايا بتركيز من واحد إلى مليوني خلية في 20 إلى 100 ميكرولترات من المتوسطة تستكمل مع 2.7 إلى 4 ملليغرام لكل ملليلتر مصفوفة خارج الخلية وأي عوامل نمو أو إضافات أخرى من الفائدة. لزرع الخلايا السرطانية، وذلك باستخدام حلقة غير عصا، وضع ما يصل إلى ست بيضات ليتم زرعها على رف البيض ولفة حواف فيلم شفاف خلع الملابس نحو النافذة المفتوحة لإزالة الفيلم من قذائف. تحقق من ما إذا كان البيض قابلًا للحياة وصحيًا.

سوف البيض المثالي يكون وعاء كبير مع أصغر متفرعة السفن داخل وسط المنطقة المفتوحة. باستخدام ملقط قزحية منحنية منحنية، وضع حلقة غير عصا العقيمة على CAM على السفينة بشكل مثالي على نقطة فرع. استخدام قضيب اثارة الزجاج المعقم لbrade بلطف CAM والماصات تعليق خلية السرطان في وسط الحلبة.

عندما تم تسليم جميع الخلايا، ختم الافتتاح مع قطعة ربع من ستة في سبعة سنتيمترات فيلم شفافة خلع الملابس وتسمية البيض مع تعيين زرع المناسبة. ثم وضع البيض بشكل آمن في الحاضنة مع فتح قذيفة التي تواجه تستقيم. لزرع الخلايا السرطانية دون استخدام حلقة غير لاصقة، يُطرّع تعليق الخلية إلى طرف ماصات بحجم مناسب ويحمل الجزء العلوي من الحافة إخراج طرف الماصات بعناية ووضع الطرف أفقيًا في طبق زراعة الأنسجة المعقم 10 سنتيمتر.

بعد تحميل النصائح ، ضع الطبق في حاضنة درجة 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، والتحقق من البلمرة بعد 15 دقيقة. وهناك كمية صغيرة من السائل تسرب عادة كما يتم وضع كل طرف في الطبق. استخدم هذا السائل لتقدير مدى البلمرة داخل الطرف.

عندما تكون المصفوفة جاهزة، ضع طرفًا واحدًا على ماصة بحجم مناسب وينكض المكبس لإجبار تعليق الخلية البلمرة جزئياً على CAM بشكل مثالي على نقطة متفرعة من وعاء كبير متطور. باستخدام هذه الطرق، كل من الإنسان و murine خطوط سرطان المبيض وقطع الورم الأولية أسفرت عن نجاح engraftment من الأورام مع morphologies تتفق مع تلك التي لوحظت في نماذج أخرى في الجسم الحي. من أنواع الأورام المختبرة، كان نمو سرطان المبيض أقل وضوحًا بكثير وعادةً ما لا يظهر دون مساعدة تصوير الإضاءة الحيوية.

ويمكن أيضا أن تكون آثار إضافة عوامل النمو أو الهرمونات في وقت زرع اختبار باستخدام هذه الطرق. لسرطان الكلى، زرع خلايا سرطان الخلايا الكلوية واضحة من خطوط الخلايا المنشأة أو قطع من أورام الكلى البشرية الأولية تنتج سريعة، وتشكيل الورم قوية. وعلاوة على ذلك، تم استخدام العديد من الإنسان وsine البروستاتا خطوط الخلايا السرطانية والخطوط البشرية سرطان الخلايا وقطع الورم الأولية لإنشاء الأورام باستخدام هذا النموذج.

من الأهمية بمكان تجنب تعطيل CAM والأوعية الدموية والتأكد من أن CAM لا تلتزم بـ shell أثناء فتح النافذة. بعد نجاح engraftment، يمكن استخدام نموذج CAM لتقييم الفعالية العلاجية للعلاجات ذات الاهتمام أو التفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الورم.