تحديد مثبطات التفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام الفحص التحليلي المنقسم

إن التفاعل بين HBX-DDB1 هو خطوة حاسمة لتعزيز النسخ من فيروس الورم الحليمي البشري من cccDNA ، لذلك قد يصبح هذا البروتوكول أحد الأصول الرئيسية لاكتشاف العوامل العلاجية الجديدة لعلاج فيروس الورم الحليمي البشري الوظيفي. الإجراء لدينا هو بسيط ويتطلب سوى وقت قصير للشاشة. يمكن الكشف عن التفاعل الذي أختلط في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى تحلل الخلايا.

وعلاوة على ذلك، فإن جودة الفحص مرضية مع درجة عالية من الدرجة الرئيسية Z. تثبيط تفاعل HBX-DDB1 يؤدي إلى استعادة Smc5/6، مما يؤدي إلى قمع النسخ HPV، والتعبير البروتيني، وإنتاج cccDNA. هذه الآلية الجديدة للعمل المضاد للفيروسات قد تتغلب على أوجه القصور في علاجات فيروس الورم الحليمي البشري الحالية.

التفاعلات البروتينية هي فئة مهمة من أهداف المخدرات. الحمض القائم على الانقسام luciferase الموصوفة هنا، والتي تستهدف التفاعلات بين البروتينات الفيروسية والهز، قد توفر استراتيجية جديدة لتطوير علاجات للأمراض المعدية الأخرى. على الرغم من أن بروتوكولنا بسيط وسهل الفهم، قد يكون من الصعب إعادة إنتاج بعض الخطوات دون العرض التوضيحي المرئي.

وهكذا، فإن مظاهرة البصرية تكون عونا كبيرا لفهم البروتوكول لدينا. تبدأ بذر خمس مرات 10 إلى خلايا HEK293T 5 في طبق 100 ملليمتر مع 10 ملليلتر من DMEM، واحتضانها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تمييع ميكروغرام واحد لكل من HBx-LgBit وSmBit-DDB1 التعبير عن plasmids الحمض النووي ومخزن تكاثف الحمض النووي لحجم إجمالي قدره 300 ميكرولترات.

إضافة 16 ميكرولتررس من محلول محسن، وخلط الأنابيب عن طريق دوامة لثانية واحدة. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق، ثم إضافة 60 ميكرولترات من كاشف transfection. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان، واحتضان العينة لمدة ثماني دقائق أخرى.

وفي الوقت نفسه، التعرق المتوسطة من الطبق مع الخلايا وغسلها مع خمسة ملليلتر من PVS. التعرق في PVS وإضافة سبعة ملليلتر من DMEM. إضافة ثلاثة ملليلتر من DMEM إلى الأنبوب مع مجمعات transfection، ماص صعودا وهبوطا لخلط، وإضافة الخليط إلى الخلايا.

ثم، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 ساعات. بعد الحضانة، وإزالة المتوسط ثقافة المستهلكة، وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من PVS. إزالة PVS في ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين EDTA، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لفصلها.

بعد ذلك، إضافة أربعة ملليلتر من DMEM، وتشتيت المتوسطة عن طريق الأنابيب على سطح طبقة الخلية عدة مرات، ونقل التعليق إلى أنبوب. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم تجاهل نابيرانت، وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من PVS. كرر cetrifugation وتجاهل اابر.

ثم، إعادة تعليق بيليه الخلية مع خلية متوسطة الخلية المخزنة تكملها 10٪ FBS إلى كثافة البذر من مليون خلية لكل ملليلتر. Pipette 50 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 96 جيدا، وإعادة الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات. في حين أن الخلايا هي احتضان، وتمييع مركبات الفحص والمذيبات إلى 13.5 X التركيز.

إضافة 12.5 ميكرولترات من الركيزة الإنارة إلى كل بئر، وتحتضن لوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قياس الإنارة خط الأساس مع مضيئة، وإضافة خمسة ميكرولترات من المركبات وDMSO تسيطر على كل بئر بعد ذلك مباشرة. قياس الإنارة كل 30 دقيقة لمدة ساعتين، ثم حساب الآثار المثبطة للمركبات بالمقارنة مع العلاج DMSO.

وقد تم قياس إشارات الإنارة الأساسية، واحتُسبت نسبة الإشارة إلى الخلفية لتكون أكبر من 80. وكان رئيس الوزراء Z أكبر من 0.5، مما يشير إلى أن هذا النظام هو اختبار مقبول لفحص عالية الإنتاجية. من خلال تحديد عتبة إلى أكثر من 40٪ تثبيط بالمقارنة مع مراقبة DMSO فقط, تم تحديد nitazoxanide كدواء مرشح.

لقد حددنا سابقا nitazoxanide كمثبط للتفاعل HBX-DDB1 من خلال فحص مكتبة مجمع التفاعل على نطاق صغير مع هذه الطريقة. باستخدام nitazoxanide، نؤكد أن تثبيط تفاعل HBX-DDB1، وهذا الحد من النسخ الفيروسي، ومستويات المنتجات الفيروسية اللاحقة. يجب تحديد الجزء الأمثل من لوسيفيراز الانقسام تنصهر إلى البروتين المستهدف مسبقا.

في هذه الحالة، انصهر HPX إلى بت كبير في نهاية C من HPX وDDB1 تنصهر على بت صغير في نهاية نهاية DDB1 قدمت أفضل النتائج.