توصيف إكسون تخطي الكفاءة في DMD عينات المرضى في التجارب السريرية من Oligonucleotides Antisense
مايو 7, 2020
هنا، نقدم التوصيف الجزيئي لdytrophin 38 التعبير باستخدام تسلسل سانجر، RT-PCR، وغرب النشاف في التجارب السريرية.
يوفر هذا البروتوكول منهجية موحدة لإعداد ومعالجة الأنسجة العضلية في بيئات ما قبل السريرية والتجارب السريرية، وهو أمر مهم للحصول على نتائج موثوقة داخل مجال DMD. التقنيات ذات الصلة لoutout تخطي exon لDD. والميزة الرئيسية هي أنها راسخة وقابلة للتكرار إذا نفذت بشكل جماعي.
وتركز هذه التقنيات أساسا على تخطي exon في DMD، ولكن مع تغيير التمهيديات، يمكن تطبيق نفس التقنيات على الأمراض الأخرى المعالجة مع العلاجات الربط. ويمكن استخدام هذه الأساليب لتحقيق exon تخطي كفاءة على حد سواء وRNA والبروتين. لإعداد عينة للتحليل ، خلط أول كميات متساوية من اللثة والمياه tragacanth حتى يصبح اللثة لينة ولزجة.
تحميل هذا الخليط في 25 ملليلتر الحقن والاستغناء 0.5 إلى سنتيمتر واحد من العلكة على أقراص الفلين الفردية. تسمية الأقراص على الجانب الآخر ووضع حاوية من إيسوبنتان في النيتروجين السائل حتى يتجمد بعض السائل. ضع كل عينة في العلكة tragacanth على الأقراص مع محور طولي لكل عمودي العضلات على الفلين.
ضع العلكة في قاع كل عضلة للمساعدة في الإمساك بالعضلات في مكانها ، واستخدم الملاقط لتجميد العينات في الهزوبين الباردة. نقل العينات بشكل مستمر لمدة دقيقة واحدة أو حتى المجمدة تماما قبل وضعها مؤقتا على الجليد الجاف. ثم ضع العينات في قارورة زجاجية للتخزين 80 درجة مئوية.
لقسم الأنسجة العضلية المجمدة للتحليل، تعيين التبريد إلى درجة حرارة العمل من 25 درجة مئوية، وتركيب كتلة العضلات على حامل. تقليم كتلة الأنسجة حتى يتم تحقيق أقسام مسطحة. للحصول على نسخ عكسية PCR وتحليل البقعة الغربية، والحصول على شرائح سميكة 10 ميكرومتر.
للتحليل المناعي الكيميائي، والحصول على ستة إلى ثمانية شرائح ميكرومتر سميكة، ولالطومة الاوزلين وتلطيخ، والحصول على شرائح سميكة 10 إلى 12 ميكرومتر. بعد اكتسابها، ضع الأجزاء المقطعة في أنبوبين مليلترين. تخزين العينات لPCR وغرب النشاف في 80 درجة مئوية.
هنا، يتم عرض نظام electrophoresis رقاقة، صور هلام من ردود الفعل النسخ العكسي PCR، ونتائج تسلسل الفرقة تخطي من اثنين من المرضى قبل وبعد العلاج مع oligonucleotide مضاد للانداد في مرحلة تصعيد جرعة واحد. كلا المرضى يأوون الحذف كما هو متوقع، قبل العلاج، كلا المرضى أظهرت أي تخطي ويمكن تصور فقط الفرقة غير تخطي.
بعد 12 أسبوعا من العلاج، تم تصور شريط أقل تخطي واضح للمريض الثاني، ومع ذلك، كان لا يزال من الصعب الكشف عن أي منتج تخطي للمريض الأول. وأظهرت نتائج التسلسل سلسلة من exons 47 و 54 للمريض الثاني، والإيضانات، 44 و 54 للمريض الأول. لحساب النسبة المئوية المتخطية، تم تقسيم تركيز العث للشرائط التي تم تخطيها بواسطة الشرائط التي تم تخطيها وغير المُركّب.
كما هو متوقع، لم يتم الكشف عن أي عصابة ديستروفين بواسطة لطخة الغربية قبل العلاج. بعد العلاج ، تم الكشف عن شريط من المريض الثاني مع وزن جزيئي أقل مقارنة بتلك التي لوحظت في السيطرة الصحية. المريض الأول، ومع ذلك، لم تظهر مستويات يمكن الكشف عنها من الديستروفين بعد العلاج.
من المهم التعامل مع الأنسجة العضلية بشكل صحيح ، ووضع كل عينة على علكة تراجكانث بطريقة متسقة. يمكن تحليل أقسام الأنسجة بعدة طرق مختلفة، بما في ذلك صناعية ل PCR، PCR الرقمية، لطخة الغربية، الكيمياء المناعية، ومع أنواع مختلفة من omics. هذه التقنيات يمكن تسريع، وتطوير، exon إضافية تخطي المخدرات التي تستهدف إكسون مختلفة، ويمكن تطبيقها على تطوير الفيروسية القائمة ومرة أخرى في تحرير لDD.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منهجية موحدة لتحضير وتعامل مع أنسجة العضلات في التجارب السريرية المتعلقة بمرض ضمور العضلات دوشين (DMD). وينصب التركيز على تقنيات تخطي الإكسون، والتي تُعد حاسمة لتطوير علاجات فعالة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- التجارب السريرية
خلفية علمية
- يُعد ضمور العضلات دوشين (DMD) مرضاً شديداً يسبب ضمور العضلات.
- يُعتبر تخطي الإكسون نهجاً علاجياً واعداً لعلاج ضمور العضلات دوشين (DMD).
- تُعد المعالجة الموثوقة للأنسجة أمراً ضرورياً للحصول على نتائج تجريبية دقيقة.
- يمكن للأساليب الموحدة أن تعزز من قابلية تكرار النتائج في الأبحاث.
الغرض من الدراسة
- تأسيس بروتوكول موثوق لتحضير أنسجة العضلات.
- تسهيل تجارب تخطي الإكسون لمرض DMD.
- توفير إطار عمل قابل للتطبيق على أمراض أخرى تُعالج بعلاجات الربط (splicing therapies).
الطرق المستخدمة
- تحضير الأنسجة العضلية باستخدام صمغ التراغكانث والأيزوبنتان.
- تجميد وتقطيع عينات العضلات من أجل التحليل.
- تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام النسخ العكسي (RT-PCR) ولطخة ويسترن للكشف عن تعبير بروتين الدستروفين.
- التسلسل الجيني لتحليل كفاءة تخطي الإكسون.
النتائج الرئيسية
- نجاح في تصوير النطاقات المتخطاة لدى المرضى الذين تلقوا العلاج.
- الكشف عن بروتين dystrophin لدى مريض واحد بعد العلاج.
- تباين في الاستجابة للعلاج بين المرضى.
- التأكيد على أهمية التعامل المتسق مع الأنسجة لضمان دقة النتائج.
الاستنتاجات
- تعد الطرق الموحدة بالغة الأهمية لتطوير علاجات DMD.
- يظهر تخطي الإكسونات إمكانات واعدة، ولكنه يتطلب مزيداً من التحسين.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذه الطرق من أجل تطبيقات أوسع.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يحدد هذا البروتوكول سير عمل معياري لتقييم كفاءة تخطي الإكسون في عينات المرضى المصابين بـ DMD، مما يدعم بشكل مباشر التحقق من الهدف في تطوير قليلات النوكليوتيد المضادة للمعنى. ومن خلال تمكين القياس الكمي للاستعادة الجزيئية، فإنه يوفر تقليلاً للمخاطر الميكانيكية لعلاجات تخطي الإكسون 53 مثل viltolarsen. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في الانتقال من المرحلة قبل السريرية إلى السريرية من خلال ربط القراءات الكيميائية الحيوية بآلية العلاج.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء تخطي الإكسون بوساطة قليلات النوكليوتيد المضادة للحس كفرضية علاجية في العينات المستمدة من المرضى.
- القيمة التشغيلية: يوفر طرقاً قابلة للتكرار في تسلسل سانجر، وتفاعل البوليميراز المتسلسل النسخي (RT-PCR)، ولطخة ويسترن لتأكيد النشاط الجزيئي المستهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد نسب كمية للنطاقات المتخطاة إلى النطاقات الكلية لتقييم الاستجابة للجرعة في كفاءة تخطي الإكسون.
- القيمة التشغيلية: توحيد بروتوكولات تحضير الأنسجة وتقطيعها لضمان إمكانية تكرار المقايسة عبر مجموعات العينات قبل السريرية والسريرية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم تحليل الأنظمة ذات الصلة بالمرض من خلال توصيف استعادة dystrophin في خزعات عضلية حقيقية من المرضى.
- القيمة التشغيلية: يتيح الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري باستخدام قراءات جزيئية متسقة عبر أنظمة النماذج المختلفة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر تأكيداً جزيئياً لآلية العمل قبل اختبار الفعالية الوظيفية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تؤكد تصحيح وصل الإكسونات المستهدف في عينات المرضى، مما يدعم التحقق من الفرضية الخاصة بـ antisense oligonucleotides.
- الفحص: توفر نسباً كمية لتخطي الإكسونات عبر تصوير الهلام والتسلسل، مما يسمح بمقارنة المركبات.
- التحليلات: توفر تقديراً كمياً للنطاق المتخطى بناءً على التركيز المولي لإجراء تحليل مقارن بين الجرعات والمرضى.
- البحث الانتقالي: تربط تخطي الإكسونات الجزيئي بالكشف عن بروتين dystrophin، مما يجسّر الفجوة بين الآلية على مستوى RNA والنتيجة على مستوى البروتين.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس إطاراً قابلاً لإعادة الاستخدام للتعامل مع الأنسجة وتحليلها، بحيث يكون قابلاً للتطبيق على أهداف إكسونات متعددة وعلاجات الوصل.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تقليل المخاطر الآلية من خلال التصوير المباشر لتخطي الإكسون واستعادة الدستروفين في الأنسجة البشرية.
- القيمة التشغيلية: يضمن التضمين القياسي باستخدام صمغ التراجكانث والتقطيع بالتجميد اتساق العينات وتقليل التباين.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير دليل جزيئي على ارتباط الهدف قبل الوصول إلى النقاط النهائية الوظيفية.
- تأثير المحفظة: يتيح ترتيب أولويات قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المعدلة وفقاً للمخاطر بناءً على كفاءة تخطي الإكسون في الأنماط الجينية ذات الصلة للمرضى.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك RT-PCR، وWestern blotting، وتسلسل Sanger.
- تعتمد على جهاز cryostat لتقطيع الأنسجة والنيتروجين السائل/isopentane للتجميد السريع.
- تستلزم بروتوكولات قياسية لمناولة الأنسجة للحفاظ على سلامة العينات عبر المواقع أو النقاط الزمنية المختلفة.
- يجب مراعاة التباين في الطفرات الخاصة بكل مريض عند تصميم البادئات للكشف عن تخطي الإكسون (exon skipping).
- تتقيد بالطبيعة شبه الكمية للطرق القائمة على الهلام (gel-based methods) دون التحقق من النتائج بواسطة digital PCR أو capillary electrophoresis.
![متعددة اكسون تخطي عن طريق أليغنوكليوتيد] كوكتيل العقاقير في ضمور العضلات المرتبطة X الناب](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F53776.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.063Z&w=384&q=75)
