طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية
فبراير 27, 2020
يصف هذا البروتوكول طريقة cryoAPEX ، حيث يمكن ترجمة بروتين غشاء APEX2 الموسوم عن طريق المجهر الإلكتروني المنقول داخل بنية فائقة للخلايا محفوظة على النحو الأمثل.
هذه الطريقة تجمع بين القدرة على وصمة عار لبروتين غشاء مع الحفاظ أيضا على سلامة الغشاء والهندسة المعمارية دون الخلوية. لذلك هو حقا قوية لترجمة بالضبط البروتين المرتبطة غشاء. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين استخدام علامة قوية قابلة للتكنس وراثيا، APEX2، مع أحدث الطرق في الحفظ الخلوي للمجهر الإلكتروني، بما في ذلك التبريد واستبدال التجميد.
معا، وهذه تسمح بتوطين البروتين الدقيق داخل خلية محفوظة جيدا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتشريح الآليات التي الفيروسات النسخ المتماثل داخل الخلية المضيفة. الفيروسات في كثير من الأحيان سوف خطف البروتينات المضيفة خلال مخطط العدوى الخاصة بهم.
الفيروسات هي الجينوم الصغير، الذي يستخدمونه لتكرار داخل هذه الخلايا المضيفة. في الآونة الأخيرة ، كنا قادرين على في البيانات غير المنشورة ، وتسمية هذه البروتينات باستخدام هذه التكنولوجيا لفهم كيفية تكرار الفيروسات. أثبتت هذه التقنية أهمية حاسمة في دراسة تعاونية حديثة حول السم البكتيري الذي يسبب انهيار golgi.
باستخدام cryoAPEX ، تمكنا من توطين السم بدقة مع قطع golgi المجزأة ، وهو أمر كان من الصعب حقا أن نرى خلاف ذلك باستخدام تقنيات المناعة الطبيعية. ومن خلال هذه التقنية، ستكون إيلين ميهيلك، طالبة الدراسات العليا، وناتسبة باحثة، ستيفاني أنجل، من مختبراتنا. بعد زرع خلايا HEK293 في الطبق، transfect الخلايا مع APEX2 الموسومة الثدييات التعبير plasmids باستخدام كاشف transfection وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
في 12-15 ساعة بعد transfection، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. ثم، وغسل قبالة الخلايا مع برنامج تلفزيوني من الطبق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 500 x ز لمدة خمس دقائق.
إزالة بعناية فائقة وإعادة تعليق بيليه في مليلترين من 2٪ من glutaraldehyde و 0.1 المولى الصوديوم cacodylate العازلة في درجة حرارة 7.4 درجة الحرارة في الغرفة. ضع العينة على الجليد لاحتضان لمدة 30 دقيقة. ثم، بيليه العينة في 500 × ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
غسل بيليه ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع كل ملليلتر اثنين من 0.1 الصوديوم المولى cacodylate العازلة عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة عظمى. لتنفيذ رد فعل البيروكسيديز، وغسل بيليه عن طريق إعادة تعليق في ثلاثة ملليلتر من حل DAB تليها بيليه في 500 × ز لمدة خمس دقائق.
ثم, إعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من حل DAB مع بيروكسيد الهيدروجين 5.88 ميليمولار. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيليه يصبح البني اللون واضح، مما يدل على وجود المنتج رد فعل DAB غير قابلة للذوبان.
بعد غسل مرة أخرى مع cacodylate الصوديوم العازلة في DMEM، وفقا للمخطوطة، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولترات من محلول cryoprotectant من DMEM تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين و 15٪ بولين المصل البقري. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentuge 0.5 ملليلتر. بيليه مرة أخرى، وزيادة طفيفة في سرعة الطرد المركزي من 500 x ز.
تجاهل غالبية من افرا، وضمان أن يتم ترك ما يكفي من السائل بحيث بيليه لن تجف. ويك بعيدا أي السائل المتبقية من بيليه الخلية باستخدام زاوية من مسح المختبر أو منشفة ورقية. السماح بما يكفي من السائل يبقى أن بيليه يشكل عجينة، مماثلة في الاتساق لملبن الأسنان.
pirate اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من بيليه الخلية وترسب على الناقل غشاء. ملء بئر الناقل غشاء تماما بحيث التوتر السطح يخلق قبة طفيفة على القمة. حرك حامل الغشاء في الكارتريدج وآمن.
ضع الكارتريدج في جهاز HPF الذي تم تهيؤه والضغط على بدء التجميد. حفظ الخراطيش مغمورة في النيتروجين السائل، وإزالة الناقل غشاء من خرطوشة لها. وضع في كبسولة بلاستيكية ووضع كبسولة بلاستيكية في كريويلي كامل من النيتروجين السائل.
في غطاء محرك السيارة الكيميائي، إعداد ملليلتر واحد لكل عينة من محلول من 0.2٪ الوزن من قبل حجم حمض التانيك و 5٪ DI الماء في الأسيتون في كريوفيال. وضعها في النيتروجين السائل لتجميد. وضع تجميد استبدال مزيج قارورة واحدة و Cryovials التي تحتوي على الكريات الخلية المجمدة في غرفة عينة وحدات استبدال التجميد.
نقل الكبسولة الداخلية التي تحتوي على الناقل غشاء من قارورة النيتروجين السائل إلى القارورة المقابلة التي تحتوي على مزيج استبدال التجميد واحد. بدء بروتوكول استبدال التجميد في 90 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، وقفة استبدال تجميد وغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع الأسيتون الذي تم تبريده إلى 90 درجة مئوية.
بعد ذلك، في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وإعداد ملليلتر واحد لكل عينة من محلول من 1٪ أوزميوم تتروكسيد، 0.2٪ خلات أورانيل، و 5٪ DI الماء في الأسيتون في كريوفيال ووضعها في النيتروجين السائل لتجميد. وضع Cryovials مع مزيج استبدال تجميد اثنين في وحدة استبدال تجميد ونقل كبسولات من الأسيتون غسل الثالث في مزيج استبدال تجميد اثنين من القوارير. احتضانهم وتجميد مزيج استبدال اثنين لمدة 72 ساعة في 90 درجة مئوية، تليها الاحترار التدريجي إلى الصفر درجة مئوية على مدى 12-18 ساعة.
الحفاظ على درجة الحرارة عند درجة الصفر مئوية وإضافة الأسيتون قبل تبريدها في قارورة لغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل من. إعداد خليط الراتنج من اختيار في القارس البلاستيك وفقا لاتجاهات الشركة المصنعة وإضافة 2٪ 4٪ و 8٪ من الراتنج في قارورة لغمر الكبسولات. احتضان لمدة ساعتين كل في درجة الصفر مئوية.
ثم، احتضان في 15٪30٪60٪90٪، و 100٪ مكونات الراتنج من A، B، و D فقط لمدة أربع ساعات لكل في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 ساعة، إعداد خليط من مكونات الراتنج A، B، C، D واحتضان لمدة أربع ساعات. وضع الناقلات غشاء مع خلية بيليه الجانب حتى في قوالب التضمين شقة وملء مع خليط الراتنج A، B، C، و D.وضع لهم في فرن البلمرة في 60 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة.
بعد البلمرة، وإزالة كتل من القالب ووضع العينة في تشاك العمودي من microtome فائقة حيث يمكن تصورها مع التكبير. فصل الناقل غشاء من كتلة من قبل مزيج من النيتروجين السائل الدابس على الناقل غشاء لفصل المعدن من البلاستيك، واستخدام شفرة حلاقة لرقاقة بعيدا الراتنج حول الناقل غشاء. عند فصلها، رفع بلطف بعيدا الناقل غشاء، وترك قبة بيليه الخلية على وجه الكتلة.
وضع كتلة مع بيليه خلية المكشوفة التي تواجه التصاعدي في قالب التضمين شقة أعمق قليلا من القالب الأول وملء مع مكونات الراتنج A، B، C، وD.36 بالبلمرة في 60 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة. تقليم كتلة حول بيليه الخلية باستخدام شفرة الحلاقة. ثم ضع الكتلة في العينة تشاك على الذراع المقطع من microtome فائقة.
باستخدام كوب أو سكين الماس، تقليم كتلة في شكل شبه منحرف المحيطة بشكل وثيق بيليه الخلية. الحصول على 90 نانومتر جدا أقسام رقيقة من بيليه الخلية باستخدام سكين الزجاج أو الماس. التقط شريط من المقاطع على شبكة TEM.
جفف الشبكة عن طريق نشاف الحافة على قطعة من ورق التصفية وتخزينها في مربع تخزين شبكة TEM. جبل الشبكة على حامل TEM ووضع حامل في المجهر. استخدم تيكناي T12 في 80 كيلوفولت لفحص عينات cryoAPEX.
الحصول على صور من الخلايا والهياكل دون الخلية من الفائدة مع وضع العلامات APEX2. في هذه الدراسة، أدى إعداد العينة بأساليب APEX التقليدية إلى وضع علامات واضحة على هياكل التشبيك المندوبية المنظمة والسلسة. في التكبير العالي ، ظهرت الأغشية المكدسة مكشكشة وكانت الفجوات غير موحدة موجودة بين كثافات الغشاء متحدة المركز ، مما يشير إلى سوء الحفاظ على الغشاء واستخراج الدهون.
العينة التي أعدتها cryoAPEX كما وضع علامات محددة بوضوح من تنظيم، وهياكل التشنجية على نحو سلس، ومع ذلك، كانت الأغشية على نحو سلس ومتوازية وكان ينظر إلى القليل من أي استخراج الدهون. كشف تحليل TEM من 90 قسمًا رقيقًا من نانومتر أن الخميرة هنتنغتون التفاعل البروتين E كانت موجودة في جميع أنحاء النتكولوم endoplasmic المحيطية وكذلك المغلف النووي. بالإضافة إلى ذلك، تم حل الخميرة هنتنغتون التفاعل البروتين E الكثافة في بؤر متباعدة بانتظام على طول غشاء الشبكي endoplasmic اللمبألونية.
كانت خميرة هنتنغتون التفاعل البروتين E التوزيع وoci مرئية أيضا في عينة أعدت مع التثبيت التقليدية والجفاف. ومع ذلك ، كان هناك اضطراب غشاء واسع والاستخراج ، مما يجعل العينة دون المستوى الأمثل. تم تنفيذ وضع العلامات APEX2 باستخدام ثلاث علامات خلوية ، منها mito-V5-APEX2 التي قدمت تلطيخ محدد من الميتوكوندريا فقط وCAAX-APEX2 تنتج تلطيخ متميز من غشاء البلازما فقط.
لم يلاحظ أي وضع العلامات في العضيات داخل الخلايا. تم تقييم تلطيخ لتجويف golgi باستخدام علامة ALPHA MAN2-APEX2 كما هو موضح في مخطوطتنا الأصلية Sengupta et al. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق ثلاثية الأبعاد مثل التصوير المقطعي للإلكترون أو الأشعة الأيونية المركزة التي تفحص المجهر الإلكتروني من أجل التحقق من التوزيع ثلاثي الأبعاد لبروتين موضع اهتمام.
وكثير من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي مواد سامة، ولذلك ينبغي قبل الاستخدام الرجوع إلى صحائف بيانات السلامة لضمان معالجة المواد الكيميائية باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتخلص منها وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة cryoAPEX لتحديد موقع البروتينات الغشائية المرتبطة بـ APEX2 باستخدام مجهر إلكتروني ناقلة، والتي تحفظ البنية فوق الخلوية للخلية. هذه التقنية حيوية لدراسة كيفية قيام الفيروسات باختطاف بروتينات الخلية المضيفة أثناء العدوى ولفهم الآليات الخلوية المعقدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الخلية
- الفحص المجهري
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- الحاجة إلى تقنيات تحفظ بنية الخلية مع السماح بتحديد موقع البروتين.
- تستخدم الفيروسات بروتينات المضيف للتكاثر، مما يستلزم دراسات تفصيلية لتحديد المواقع.
- التحديات مع تقنيات الفلورة المناعية التقليدية في مراقبة تفاعلات البروتين.
الطرق المستخدمة
- تقنيات وسم APEX2 وصبغة المناعة.
- خلايا HEK293 كنظام بيولوجي.
- طرق متقدمة في الفحص الإلكتروني مثل التجميد السريع واستبدال التجميد.
النتائج الرئيسية
- تحديد دقيق لموقع البروتينات الغشائية داخل خلايا محفوظة جيدًا.
- اكتشافات حاسمة حول تحديد موقع السموم البكتيرية التي تؤثر على الهياكل الخلوية.
- تبرهن على فعالية التقنية في فهم آليات تكرار الفيروس.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة طريقة cryoAPEX كأداة قوية للتحقيق في البروتينات المرتبطة بالغشاء.
- أهمية هذه التقنية كبيرة لمجموعة واسعة من الأبحاث البيولوجية، خاصة في علوم الفيروسات وعلم الخلية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Precise membrane protein localization is critical for target validation in drug discovery, particularly for understanding host-pathogen interactions and subcellular mechanisms of action. The cryoAPEX method enhances predictive confidence by combining genetic tagging with ultrastructural preservation, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets. This supports early discovery decisions by clarifying protein topology and compartmentalization in physiologically relevant contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving protein distribution within organelle lumens and membrane topologies.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct visualization of protein localization in structurally preserved cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing specific compartmentalization from nonspecific labeling in complex cellular environments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring antigen accessibility and structural integrity.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility via cryofixation and freeze substitution, minimizing preparation artifacts.
- Scalability: Facilitates platform reuse across membrane protein targets due to genetic tag compatibility and standardized workflow.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by preserving subcellular architecture during protein localization studies.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein effects occur in intact cellular contexts, reducing false positives in target validation.
- Preclinical Alignment: Supports biomarker validation by correlating protein localization with functional readouts in preserved systems.
Pipeline & Workflow Integration
The cryoAPEX method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing spatially resolved data that informs mechanistic understanding before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving protein localization patterns that clarify pathway involvement and subcellular function.
- Screening: Enables assay readiness by generating quantitatively interpretable localization data compatible with high-resolution imaging.
- Analytics: Yields spatial measurements and topological readouts that help teams compare protein distribution across conditions or genetic perturbations.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by preserving ultrastructure, allowing longitudinal tracking of protein behavior in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets due to the genetic encodability of APEX2 and standardized cryo-EM preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein localization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized cryofixation and freeze substitution protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing ultrastructurally resolved data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by clarifying whether target engagement occurs in the intended subcellular compartment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transfection, and electron microscopy sample preparation.
- Depends on access to high pressure freezers, freeze substitution units, and transmission electron microscopes.
- Necessitates cross-team standardization between molecular biology and imaging teams for consistent tag expression and processing.
- Involves adaptation considerations for different cell types and expression systems to maintain labeling efficiency and ultrastructural preservation.
- Involves practical limitations including chemical safety requirements for glutaraldehyde, osmium tetroxide, and uranyl acetate, necessitating proper PPE and waste handling.
