الكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي في الخلايا المنضمة من قبل 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين Diacetate تلطيخ
يونيو 23, 2020
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوي (ROS) باستخدام 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA). يمكن لهذه الطريقة تصور تعريب ROS الخلوي في الخلايا المُلزِمة مع مجهر الفلوريسنس وقياس شدة ROS مع قارئ لوحة الفلوريسين. وهذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة.
ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوية في الخلايا المتمسكة مع المجهر المفلور فقط، وقياس كثافة أنواع الأكسجين التفاعلية مع قارئ لوحة الفلوريسين. هذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة. ابدأ بذر مرتين 10 إلى الخلايا السرطانية القولونية HCT116 الخامسة في DMEM في كل بئر من 24 بئرًا.
احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل الوسيطة الثقافية بـ 100 كبريتات حديدية صغيرةمولار، أو 10 وسيط يحتوي على دوكسوروبيسين ميكرومولار، واحتضان الطبق لمدة 24 ساعة أخرى. إعداد حل DCFH-DA عن طريق حل 4.85 ملليغرام من DCFH-DA في ملليلتر واحد من DMSO لجعل حل مخزون 10 ملليمولار.
الحق قبل إضافته إلى الآبار، وتمييع الأسهم مع DMEM قبل الدافئة لجعل حل العمل 10 micromolar، ودوامة لمدة 10 ثوان. لطخة الخلايا، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على المخدرات، وغسلها مرة واحدة مع DMEM. إضافة 500 ميكرولترات من DCFH-DA حل العمل في كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة، وإزالة DCFH-DA من الآبار، وغسلها مرتين مع DMEM، ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. ثم ، إضافة 500 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. استخدام قناة البروتين الفلورسنت الخضراء على المجهر الفلوريسنس لالتقاط صور تمثيلية للخلايا.
ثم إزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة فحص المناعة المشعة إلى كل بئر. احتضان لوحة على الجليد لمدة خمس دقائق، وجمع lysates الخلية في أنابيب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب في 21، 130 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
ثم نقل 100 ميكرولترات من السوبر إلى لوحة سوداء 96 جيدا. استخدم قارئ الصهرات الصغيرة في الطول الموجي للإثارة من 485 نانومتر، وطول موجة من الانبعاثات من 530 نانومتر، لقياس الفلوروس في كل بئر. المقبل، وقياس تركيز البروتين مع مقايسة برادفورد عن طريق نقل ميكرولتر واحد من السوبر إلى لوحة واضحة 96 جيدا مع 100 ميكرولترات من محلول تحليل البروتين.
استخدام تركيزات البروتين لتطبيع شدة الفلوريسنس. تم علاج خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 مع 100 كبريتات حديدية ميكرومولار، أو 10 دوكسوروبيسين ميكرومولار، للحث على الإجهاد التأكسي. كما هو متوقع، تم زيادة الفلورس الأخضر بشكل كبير من قبل كلا العلاجين.
لتحديد التغيرات الكثافة النسبية، تم lysed الخلايا وتطبيعها مع تركيزات البروتين. وقد زادت شدة الفلورسينس النسبية زيادة كبيرة بسبب كبريتات الحديد أو دوكسوروبايسين. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تجعل DCFH-DA حل جديدة وتجنب التعرض للضوء، وكذلك للحد من اضطراب حالة الخلية، وأداء برنامج تلفزيوني واسعة غسل الحق قبل التقاط الصورة.
بالإضافة إلى الكشف عن إجمالي ROS بواسطة هذا البروتوكول، يمكن إجراء ROS على وجه التحديد مثل بيروكسيد.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولاً للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الخلوية الكلية باستخدام DCFH-DA. تسمح هذه الطريقة بتصوير تموضع ROS في الخلايا الملتصقة وقياس شدة ROS كمياً.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- البيولوجيا الخلوية
- تحليل أنواع الأكسجين التفاعلية
- المجهر الفلوري
خلفية علمية
- تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دوراً حاسماً في التأشير الخلوي.
- يمكن أن يوفر فهم تموضع ROS رؤى حول العمليات الخلوية.
- تُستخدم تقنيات الفلورة بشكل شائع للكشف عن ROS.
- تم تصميم هذا البروتوكول ليكون سهل الاستخدام وفعالاً من حيث التكلفة.
الغرض من الدراسة
- توفير طريقة موثوقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا الملتصقة.
- تمكين التصوير والقياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام المجهر الفلوري.
- تبسيط العملية للباحثين في هذا المجال.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 في طبق يحتوي على 24 بئراً.
- تحضين الخلايا مع كبريتات الحديدوز أو الدوكسوروبيسين.
- تحضير محلول DCFH-DA للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS).
- استخدام المجهر الفلوري وقارئ الأطباق للتحليل.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لتمركز ROS في الخلايا.
- أظهر القياس الكمي لكثافة ROS فعالية هذه الطريقة.
- أثبت البروتوكول أنه بسيط وفعال للباحثين.
- نهج فعال من حيث التكلفة لتحليل ROS في الدراسات الخلوية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة مباشرة للكشف عن ROS.
- يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا الملتصقة.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذه الطريقة للحصول على رؤى أعمق حول الآليات الخلوية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر الكشف الكمي عن إجمالي أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا الملتصقة باستخدام صبغ DCFH-DA قراءة معيارية للإجهاد التأكسدي، وهو عامل رئيسي في نمذجة الأمراض ودراسات الاستجابة للعقاقير. تتيح هذه الطريقة تقييماً قوياً لحالة الاختزال والأكسدة الخلوية عقب الاضطرابات الكيميائية أو الجينية، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية والتحقق من صحة الأهداف في مراحل الاكتشاف المبكرة. كما أن فعاليتها من حيث التكلفة وقابليتها للتوسع تجعلها مناسبة للدمج في عمليات الفرز عالية الإنتاجية وسير العمل التحويلي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء الكمي لمسارات الإجهاد التأكسدي في نماذج خلوية ذات صلة بالأمراض.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف التي تعدل توازن الأكسدة والاختزال الخلوي.
- يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال ربط التدخلات المركبة أو الجينية بمخرجات ROS.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مقايسة قائمة على الفلورة قابلة للتكرار لتقدير كمية ROS في الخلايا الملتصقة.
- يدعم توحيد المقايسة ومعايرتها باستخدام قياسات تركيز البروتين.
- يتيح تقييماً موثوقاً للإجهاد التأكسدي الناجم عن المركبات لأغراض حملات الفرز.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يربط نتائج قياسات الإجهاد التأكسدي بنماذج الأمراض لتطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف في المختبر (in vitro) إلى التحقق قبل السريري من العوامل المعدلة لعمليات الأكسدة والاختزال.
- يوفر قيمة تنبؤية لسلامة المركبات وفعاليتها فيما يتعلق بآليات الأكسدة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتناسب بروتوكول الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) القائم على DCFH-DA مع المرحلة الممتدة من الاكتشاف المبكر إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر قراءة كمية لتعديل الإجهاد التأكسدي في الأنظمة الخلوية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات المتعلقة بالأهداف والمسارات المرتبطة بالأكسدة والاختزال.
- المسح: توفر قياسات كمية ومعيارية لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لفرز المركبات.
- التحليلات: تدمج عملية تسوية شدة الفلورة لضمان مقارنة قوية للبيانات.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج الإجهاد التأكسدي في المختبر (in vitro) بالتحقق من صحة النماذج قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تقدم مقايسة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنواع الخلايا والتدخلات المتنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في بيولوجيا الأكسدة والاختزال والتحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تبسط عملية القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من خلال سير عمل قابل للتطوير وإعادة الإنتاج.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال ربط التدخلات بنتائج الإجهاد التأكسدي.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر للأصول التي تعدل عمليات الأكسدة والاختزال.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في مجهر الفلورسنت وتشغيل قارئ الأطباق.
- يتطلب الوصول إلى البنية التحتية القياسية لزراعة الخلايا وتقدير كمية البروتين.
- يستلزم التعامل الدقيق مع كاشف DCFH-DA لتجنب التحلل الناتج عن الضوء.
- يعد توحيد خطوات الغسيل والمعايرة أمراً بالغ الأهمية لضمان قابلية تكرار النتائج.
- هذا البروتوكول قابل للتكيف مع مختلف الخطوط الخلوية الملتصقة، ولكن قد يتطلب تحسيناً لنماذج محددة.
