بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

وهذا البروتوكول يتيح تسجيل علاقة استجابة تركيز وظيفية كاملة من ناهض GPCR من مجموعة خلايا واحدة ويوفر توصيفاً ناهضاً مفصلاً حتى بالنسبة لأرقام عينات الخلايا المنخفضة. والميزة الرئيسية للدَبَة المتسلسلة هي الزيادة في الإنتاجية لأن بئراً واحداً يكفي لإجراء تحليل كامل للاستجابة للتركيز. وهذه التقنية مناسبة تماما لدراسة عملية النقل المفردة في نماذج بيولوجية نادرة ومعقدة، مثل صيغ الجهاز على الشريحة في حاويات ميكروفلويديك مغلقة.

وليس من الصعب تنفيذ البروتوكول، شريطة توافر المعدات المناسبة. إن إعداد حلول GPCR ليجوند المختلفة بتركيز مناسب هو مفتاح النجاح. مايكل سكيبا، طالب دراسات عليا، وآن ميلدنر، طالبة جامعية، من مختبرنا سوف يظهران الإجراء.

بالنسبة لذر الخلايا على صفائف القطب، أضف التركيز المناسب للخلايا إلى آبار كل صفيف قطب، والسماح للخلايا بالاستقرار بشكل متجانس على قيعان البئر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ما لا يقل عن 36 ساعة في حاضنة ثقافة الخلايا القياسية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وفحص طبقات الخلية عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة لضمان تغطية كاملة لكل قطب مع الخلايا. ثم استبدال متوسطة ثقافة الخلية في كل بئر مع حجم مناسب من قبل تدفئة، مصل خال من المتوسطة.

لبدء تسجيل المعاوقة، ضع صفيف الأقطاب الكهربائية في حامل الصفيف المتصل لمحلل المعاوقة، وتأكد من وجود اتصال مقاومة منخفض مناسب بين الأقطاب ومحلل المعاوقة. حدد نوع القطب و / أو تنسيق متعدد البئر في واجهة المستخدم للبرنامج. إذا كانت أوضاع الحصول على بيانات الترددات المفردة ومتعددة متوفرة وكان عدد الآبار التي سيتم تحليلها منخفضًا أو أن دقة الوقت ليست حرجة، حدد تسجيلات تردد متعددة.

لضمان دقة زمنية قصوى، حدد تردد مراقبة واحد. ثم ابدأ في الحصول على بيانات المقرر الزمني، وحدد مجلد البيانات لتحديد مكان حفظ البيانات. سيتم تسجيل قراءات المعاوقة في عدد محدد من الترددات لكل بئر لبدء بروتوكول الإضافة التسلسلية في الوضع المتألم لصفيفة ثمانية آبار ، إضافة 30 ميكرولترات من أدنى تركيز من ناهض من الفائدة للخلايا.

ثم اسمحوا الخلايا الاستجابة وتككيل لفترة محددة مسبقا من الوقت قبل إضافة 30 ميكرولترات من أعلى تركيز المقبل حتى تم إضافة كل تخفيف المسلسل من ناهض. لتحليل البيانات، قم بطرح مقاومة آخر نقطة بيانات قبل الإضافة الأولى للحل المتألم، ثم قم بتعيين وقت إضافة صفر إلى تسوية قيم المعاوقة. رسم الوقت من المعاوقة تطبيع، وارسم دورات زمنية الفردية لتحديد الحد الأقصى في مقاومة بعد كل خطوة إضافة.

إنشاء ورقة بيانات مع هذه القيم، و رسم قيم الحد الأقصى من تغيير المعاوقة كدالة من تركيز ناهض. ثم استخدم روتين تركيب البيانات لتحديد التركيزات الفعالة نصف القصوى والاستجابة القصوى باستخدام نموذج لوجستي أربع معلمات. في هذه التجربة التمثيلية، تمت إضافة 10 حلول مع زيادة تركيزات الهستامين بشكل متسلسل إلى الخلايا كل 15 دقيقة، وتم قياس التغير في المعاوقة في كل نقطة زمنية.

ويمكن بعد ذلك رسم التغييرات في المعاوقة كدالة لتركيز الهستامين ووظيفة نقل نموذج لوجستي رباعي البارامترات يتم تركيبه على نقاط البيانات التجريبية من سبع آبار. لحساب الممكن مستقبلات الهستامين downregulation، إزالة حساسية الخلية، أو الإفراط في التحفيز، يمكن تقليل نطاق البيانات للتحليل، كما هو مبين لهذه التجربة التسطية المسلسل واحد. ويمكن بعد ذلك تطبيق ثلاثة معلمات التحسين على البيانات، وتوفير تركيز فعال نصف أقصى من 0.75 زائد أو ناقص 0.12 ميكرومولار لهذا التحليل.

إضافة الهستامين مستقبلات خصم ديفينهيدرامين 20 دقيقة قبل الهستامين الأولى النتائج في تأخر زيادة المعاوقة داخل نظام الزهوة المسلسل, المقابلة للحاجة إلى ناهض أعلى لإثارة استجابة الخلية. في العلاقة استجابة الجرعة، يتم التعبير عن تأثير الخصم كتحول نحو اليمين من المنحنيات، المقابلة لزيادة في التركيز الفعال نصف القصوى، شريطة أن يكون الخصم يغاند تنافسية نسبة إلى ناهض. التطبيق الناجح لمخطط الزجرية سهل من الناحية الفنية ولكنه يتطلب تخطيطًا مدروسًا ، حيث أنه من الصعب تنفيذ جميع الخطوات مع التوقيت الصحيح.

وقد مهدت ال دوسينغ المسلسل الطريق لإجراء دراسات استجابة تركيز مع نظم قراءات أخرى محدودة فيما يتعلق بعدد العينات التي يتم رصدها بالتوازي. مزايا خاصة من الدوس المسلسل تسمح لدراسة نقل إشارة المستقبلات بوساطة مع قراءات جديدة تماما التي هي حساسة لتغيرات ظاهرية أخرى، مثل الخلايا المنوية. يرجى ارتداء قفازات ونظارات واقية عند إعداد حلول الأسهم من ناهض المستقبلات، لأنها قد تكون خطرة عند استنشاقها أو ابتلعها.