بروتوكول كهربية عالمي وفعال للهندسة الوراثية للأعضاء المعدية المعوية
February 18th, 2020
يصف هذا البروتوكول طريقة كهربية فعالة لنقل أربعة كيانات أعضاء ية معوية مختلفة مع بلازميدات أكبر (إلى حد 10 كيلو ب. ). ويمكن أن يؤديها في غضون يوم واحد ولا تحتاج إلى إعداد مكثف أو خاصة، ومخازن الكهرباء كثيفة التكلفة.
هذه الطريقة تمكن من نقل فعال من الثقافات الخلية 3D مثل organoids. ويمكن تيسير تطبيقات مختلفة للهندسة الوراثية. البروتوكول هو عالمي ويمكن تنفيذها في غضون يوم واحد.
لا يحتاج إلى إعداد واسع النطاق أو خاصة، والمخازن الكهربائية مكثفة التكلفة. وقد ثبت هذا الأسلوب transfection في الأورام والأعضاء صحية، ولكن يمكن تعديلها إلى spheroids وثقافة الخلايا 2D، أيضا. إذا كان تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى، من المهم التعامل مع organoids بعناية بسبب انتشارها الفردية ورد الفعل على التفكك.
رصدها مجهريا خلال الإجراء بأكمله. ابدأ بتدّح الألواح التي تضم 48 بئرًا مسبقًا عند 37 درجة مئوية لبذور ما بعد الإلتروبور، ثم أعد وسائل ثقافية أساسية وعضوية محددة وفقًا لاتجاهات المخطوطات. زراعة خمسة آبار من organoids لكل عينة كهربائي في لوحة 48 جيدا، وإعداد 230 ميكرولترات من كاشف الانفصام مع 10 ميكرومولار Y-27632 في البئر.
مراقبة organoids تحت المجهر. إزالة الوسط الثقافة من الآبار وتفكك organoids ميكانيكيا في خليط تفكك المعدة. تجمع خمسة آبار لكل عينة كهرباء في أنبوب واحد من 15 ملليلتر.
اخلط محتويات الأنبوب عن طريق الدوامة واحتضانه لمدة خمس إلى 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تحدث مجموعات من 10 إلى 15 خلية ، والتحقق من الانفصام بالمجهر. وقف الهضم عن طريق إضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من المتوسطة القاعدية دون المضادات الحيوية. الطرد المركزي الأنبوب في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق، والتخلص من عظمى، وغسل الخلايا مرتين مع أربعة ملليلترات من العازلة الكهربائية.
الطرد المركزي والتخلص من المابير بعد كل غسل. بعد يغسل، resuspend بيليه organoid في 100 ميكرولترات من العازلة electroporation مع 30 ميكروغرام من الحمض النووي plasmid. الاستغناء عن خليط الحمض النووي العضوي الكامل في cuvette الكهربائي.
تأكد من تجنب فقاعات الهواء. تعيين المعلمات electroporation كما هو موضح في مخطوطة النص والاستفادة من cuvette مع إصبع لخلط بلطف الخلايا. ضع الكوفيت في غرفة cuvette واضغط على زر المعاوقة على المُقَدِّر الكهربائي لتدوين قيمة المعاوقة.
اضغط على زر البدء لبدء برنامج الكهرباء والتحكم في قيم التيارات والجهد والطاقات المعروضة. بعد electroporation، على الفور إضافة 500 ميكرولترات من المتوسطة ثقافة دون المضادات الحيوية للخلايا ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل العينة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر وشطف cuvette مع المتوسطة القاعدية لجمع الخلايا المتبقية، ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
الطرد المركزي الخلايا في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. Resuspend بيليه في 100 ميكرولترers من مصفوفة الطابق السفلي والبذور 20 ميكرولتر قطرات في لوحة 48 جيدا قبل الدفء. احتضان لوحة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية للبليمرة وإضافة 250 ميكرولترات من المتوسط الثقافة تكمل مع Y-27632 وCHIR99021 في البئر.
لتحديد كفاءة الفقدان، تحقق من الفلوريس في التحكم في الخضوع تحت المجهر بعد 24 إلى 48 ساعة. بالنسبة لتحليل FACS، حصد الخلايا كما سبق وصفها وهضمها لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى تكون الخلايا المفردة موجودة. إضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الخلايا في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق، ثم التعرق وتجاهل افراط.
التمييز للخلايا الحية، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وإضافة جسم مضاد مناسب أو يوديد بروبديسيوم. خلط الخلايا بلطف عن طريق التنصت واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة ، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ، ثم الطرد المركزي والتخلص من السوبر.
Resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وتصفية التعليق من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب FACS. تحليل الخلايا مع جهاز FACS باستخدام استراتيجية البوابات المناسبة وتحديد كفاءة transfection. تم كهربية العضيات من أربعة كيانات سرطانية مختلفة ثلاث مرات على الأقل باستخدام 30 ميكروغرام من بلازميد صغير أو بلازميد كبير.
تم تحليلها مع تدفق 48 ساعة بعد كهربة ومسورة لشكل الخلية، والخلايا الفردية، والخلايا الحية، والتعبير eGFP. في جميع الكيانات العضوية الأربعة ، تم نقل البلازميد الصغيرة بكفاءة أعلى من أكبر. تم التوصل إلى النقل الأكثر كفاءة من البلازميد الصغيرة في organoids PDAC مع 92.1٪ GFP إيجابية الخلايا، في حين تم نقل البلازميد كبيرة مع كفاءة 46.7٪وكان أكبر البلازميد أكثر كفاءة نقل العدوى إلى organoids CRC مع متوسط كفاءة 53.4٪في حين تم نقل البلازميد الصغيرة مع متوسط كفاءة 84.3٪ وكان أصعب كيان transfect سرطان المعدة organoids ، والذي أظهر أدنى كفاءة في عملية النقل لكل من البلازميدات.
كدليل على المفهوم، تم كهربية الأعضاء الطبيعية في المعدة البشرية مع ترميز بلازميد لـ Cas9 وGFP و2sgRNAs التي تستهدف TP53. تم اختيار المستنسخين من قبل إدارة Nutlin3 وتم تأكيد الضربة القاضية TP53 من خلال تسلسل الغيلات. كما أظهرنا مع الأعضاء المعدة البشرية، والكهرباء كفاءة تمكن مختلف التلاعب قاعدة CRISPR Cas9 من الثقافات العضوية، مثل خروج المغلوب أو knockins، لذلك يمكن أن تكون على غرار أمراض مختلفة.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة كهربائية فعالة لنقل الحمض النووي إلى العضويات الهضمية الأكبر حجمًا. الطريقة سريعة، ولا تتطلب تحضيرًا موسعًا أو مستلزمات باهظة التكلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الهندسة الوراثية
الخلفية
- تعد عملية نقل الحمض النووي إلى ثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد مثل العضويات تحديًا.
- هناك حاجة إلى طرق فعالة للتلاعب الجيني.
- هذا البروتوكول قابل للتطبيق على أنواع مختلفة من العضويات.
- التعامل الدقيق مع العضويات أمر بالغ الأهمية أثناء الإجراء.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة كهربائية موثوقة لنقل الحمض النووي إلى العضويات.
- تسهيل تطبيقات الهندسة الوراثية في ثقافات العضويات.
- تقييم كفاءة النقل عبر أنواع مختلفة من العضويات.
الطرق المستخدمة
- فصل العضويات وتحضير مخاليط الكهربائية.
- نقل الحمض النووي باستخدام معايير محددة للحمض النووي البلازميدي.
- مراقبة كفاءة النقل عبر التحليل الفلوري وتحليل FACS.
- تطبيق نظام CRISPR-Cas9 لتحرير الجينات في العضويات.
النتائج الرئيسية
- ملاحظة كفاءة نقل أعلى مع البلازميدات الأصغر حجمًا.
- أظهرت العضويات السرطانية البنكرياسية أعلى كفاءة للبلازميدات الصغيرة.
- كانت العضويات السرطانية المعدية ذات أقل معدلات نقل.
- تبين نجاح تحرير الجينات في العضويات الطبيعية للمعدة.
الاستنتاجات
- طريقة الكهربائية فعالة لأنواع مختلفة من العضويات.
- تمكن من التلاعب الجيني الفعّال لنمذجة المرض.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية تقنيات أوسع نطاقًا تعتمد على CRISPR.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient genetic engineering of patient-derived gastrointestinal organoids is critical for translational disease modeling and target validation in early drug discovery. This universal electroporation protocol enables rapid, reproducible transfection of diverse organoid types, supporting high-confidence functional genomics and CRISPR-based manipulation. The method streamlines genetic perturbation workflows, reducing technical barriers and accelerating preclinical hypothesis testing across oncology and regenerative medicine portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genetic perturbation of organoids for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating CRISPR-mediated knockout and knockin studies.
- Improves predictive confidence in disease-relevant 3D models for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, genetically modified organoids for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible transfection efficiencies quantified by FACS, supporting assay reliability.
- Facilitates scalable preparation of engineered organoid systems for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of patient-specific mutations and disease states in organoid cultures.
- Provides continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports alignment with translational biomarkers through precise genome editing.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from genetic hypothesis testing to functional validation in disease-relevant organoid systems.
- Discovery Biology: Facilitates rapid null hypothesis testing and pathway interrogation in 3D models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection outputs for assay development.
- Analytics: Delivers FACS-based efficiency metrics for cross-condition comparison and optimization.
- Translational Research: Bridges engineered organoid models to preclinical disease studies and biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse organoid and spheroid systems across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal preparation and no need for specialized buffers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling rapid genetic manipulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture and handling to ensure viability and reproducibility.
- Needs access to standard electroporation equipment and FACS analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and transfection efficiency metrics.
- Adaptable to various organoid types and potentially to spheroids and 2D cultures with protocol adjustments.
- Efficiency may vary by organoid entity and plasmid size, requiring empirical optimization.
