بروتوكول كهربية عالمي وفعال للهندسة الوراثية للأعضاء المعدية المعوية

هذه الطريقة تمكن من نقل فعال من الثقافات الخلية 3D مثل organoids. ويمكن تيسير تطبيقات مختلفة للهندسة الوراثية. البروتوكول هو عالمي ويمكن تنفيذها في غضون يوم واحد.

لا يحتاج إلى إعداد واسع النطاق أو خاصة، والمخازن الكهربائية مكثفة التكلفة. وقد ثبت هذا الأسلوب transfection في الأورام والأعضاء صحية، ولكن يمكن تعديلها إلى spheroids وثقافة الخلايا 2D، أيضا. إذا كان تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى، من المهم التعامل مع organoids بعناية بسبب انتشارها الفردية ورد الفعل على التفكك.

رصدها مجهريا خلال الإجراء بأكمله. ابدأ بتدّح الألواح التي تضم 48 بئرًا مسبقًا عند 37 درجة مئوية لبذور ما بعد الإلتروبور، ثم أعد وسائل ثقافية أساسية وعضوية محددة وفقًا لاتجاهات المخطوطات. زراعة خمسة آبار من organoids لكل عينة كهربائي في لوحة 48 جيدا، وإعداد 230 ميكرولترات من كاشف الانفصام مع 10 ميكرومولار Y-27632 في البئر.

مراقبة organoids تحت المجهر. إزالة الوسط الثقافة من الآبار وتفكك organoids ميكانيكيا في خليط تفكك المعدة. تجمع خمسة آبار لكل عينة كهرباء في أنبوب واحد من 15 ملليلتر.

اخلط محتويات الأنبوب عن طريق الدوامة واحتضانه لمدة خمس إلى 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تحدث مجموعات من 10 إلى 15 خلية ، والتحقق من الانفصام بالمجهر. وقف الهضم عن طريق إضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من المتوسطة القاعدية دون المضادات الحيوية. الطرد المركزي الأنبوب في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق، والتخلص من عظمى، وغسل الخلايا مرتين مع أربعة ملليلترات من العازلة الكهربائية.

الطرد المركزي والتخلص من المابير بعد كل غسل. بعد يغسل، resuspend بيليه organoid في 100 ميكرولترات من العازلة electroporation مع 30 ميكروغرام من الحمض النووي plasmid. الاستغناء عن خليط الحمض النووي العضوي الكامل في cuvette الكهربائي.

تأكد من تجنب فقاعات الهواء. تعيين المعلمات electroporation كما هو موضح في مخطوطة النص والاستفادة من cuvette مع إصبع لخلط بلطف الخلايا. ضع الكوفيت في غرفة cuvette واضغط على زر المعاوقة على المُقَدِّر الكهربائي لتدوين قيمة المعاوقة.

اضغط على زر البدء لبدء برنامج الكهرباء والتحكم في قيم التيارات والجهد والطاقات المعروضة. بعد electroporation، على الفور إضافة 500 ميكرولترات من المتوسطة ثقافة دون المضادات الحيوية للخلايا ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل العينة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر وشطف cuvette مع المتوسطة القاعدية لجمع الخلايا المتبقية، ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.

الطرد المركزي الخلايا في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. Resuspend بيليه في 100 ميكرولترers من مصفوفة الطابق السفلي والبذور 20 ميكرولتر قطرات في لوحة 48 جيدا قبل الدفء. احتضان لوحة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية للبليمرة وإضافة 250 ميكرولترات من المتوسط الثقافة تكمل مع Y-27632 وCHIR99021 في البئر.

لتحديد كفاءة الفقدان، تحقق من الفلوريس في التحكم في الخضوع تحت المجهر بعد 24 إلى 48 ساعة. بالنسبة لتحليل FACS، حصد الخلايا كما سبق وصفها وهضمها لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى تكون الخلايا المفردة موجودة. إضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي الخلايا في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق، ثم التعرق وتجاهل افراط.

التمييز للخلايا الحية، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وإضافة جسم مضاد مناسب أو يوديد بروبديسيوم. خلط الخلايا بلطف عن طريق التنصت واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة ، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ، ثم الطرد المركزي والتخلص من السوبر.

Resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وتصفية التعليق من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب FACS. تحليل الخلايا مع جهاز FACS باستخدام استراتيجية البوابات المناسبة وتحديد كفاءة transfection. تم كهربية العضيات من أربعة كيانات سرطانية مختلفة ثلاث مرات على الأقل باستخدام 30 ميكروغرام من بلازميد صغير أو بلازميد كبير.

تم تحليلها مع تدفق 48 ساعة بعد كهربة ومسورة لشكل الخلية، والخلايا الفردية، والخلايا الحية، والتعبير eGFP. في جميع الكيانات العضوية الأربعة ، تم نقل البلازميد الصغيرة بكفاءة أعلى من أكبر. تم التوصل إلى النقل الأكثر كفاءة من البلازميد الصغيرة في organoids PDAC مع 92.1٪ GFP إيجابية الخلايا، في حين تم نقل البلازميد كبيرة مع كفاءة 46.7٪وكان أكبر البلازميد أكثر كفاءة نقل العدوى إلى organoids CRC مع متوسط كفاءة 53.4٪في حين تم نقل البلازميد الصغيرة مع متوسط كفاءة 84.3٪ وكان أصعب كيان transfect سرطان المعدة organoids ، والذي أظهر أدنى كفاءة في عملية النقل لكل من البلازميدات.

كدليل على المفهوم، تم كهربية الأعضاء الطبيعية في المعدة البشرية مع ترميز بلازميد لـ Cas9 وGFP و2sgRNAs التي تستهدف TP53. تم اختيار المستنسخين من قبل إدارة Nutlin3 وتم تأكيد الضربة القاضية TP53 من خلال تسلسل الغيلات. كما أظهرنا مع الأعضاء المعدة البشرية، والكهرباء كفاءة تمكن مختلف التلاعب قاعدة CRISPR Cas9 من الثقافات العضوية، مثل خروج المغلوب أو knockins، لذلك يمكن أن تكون على غرار أمراض مختلفة.