LINE-1 تحليل الميثيل في الخلايا الجذعية Mesenchymal تعامل مع الحويصلات خارج الخلية المستمدة من العظام

ميثيل الحمض النووي هو واحد من أكثر التواقيع اللاجينية دراسة. يتميز العديد من أنواع السرطان بالتغيرات في مستويات ميَلَل الحمض النووي، والتي ترتبط بتعبيرات جينية شاذة وغير ذلك من التشوهات الجينومية. والعناصر النووية الطويلة المتخللة هي متواليات جينومية متكررة قابلة للنقل عادة ما تكون فيها مستويات عالية من المثيلات.

ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تصبح فرط thmethylated في السرطان ، مما يؤدي إلى تنشيطها ويؤدي إلى عدم الاستقرار في الكروموسومات. في هذه الدراسة، عالجنا الخلايا الجذعية السيسينشيمالية مع الخلايا خارج الخلية المشتقة من العظام لمعرفة ما إذا كانت المركبات الكهربائية السرطانية يمكن أن تؤثر على ميثيل LINE-1 في MECs. يحتوي مصل الأبقار الجنيني، الذي يعد مكونًا أساسيًا من وسائل بث الخلايا الثديية، على عدد كبير من المركبات الكهربائية المشتقة من الأبقار.

هذه Evs سوف تتداخل مع تحليل EVS من الخلايا التي تهمنا ، وبالتالي ، عندما تنمو الخلايا لعزل EV ، من المهم استخدام EV - استنفاد FBS. تأخذ FBS في أنابيب فائقة التركيز ووضعها في دلاء فائقة التركيز. تحقيق التوازن بين الدلاء إلى داخل 10 ملليغرام من بعضها البعض قبل تحميلها على الدوار يتأرجح.

ضع الدوار في الطارد الفائق الحرارة وقم بتشغيله على 100، 000 غ لمدة 19 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد المدى، وجمع بعناية الطبقة العليا الملونة الخفيفة من عظمى ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر. لا تزعج أو pipet بيليه البني الداكن لأنه يحتوي على EVs من FBS.

تمرير عظمى من خلال مرشح 0.22 ميكرون في أنبوب جديد 50 ملليلتر. هذا تصفية تعقيم، EV- استنفاد FBS يمكن الآن أن تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية عند تزايد الخلايا لعزلة EV. جمع وسائل الإعلام مشروط من خلايا osteosarcoma التي تزرع في وسائل الإعلام EV المنضب.

لإزالة الخلايا ومخلفات الخلايا، الطرد المركزي وسائل الإعلام مكيفة في 2500 G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنابيب فائقة التركيز والتوازن بينهما كما في وقت سابق. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 100،000 G لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية.

تجاهل بعناية supernatant ترك حوالي ملليلتر واحد في الجزء السفلي. إضافة حوالي 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب و pipet بلطف من أجل غسل وإعادة تعليق بيليه EV. تحقيق التوازن بين الأنابيب وتنفيذ جولة أخرى من الطرد فائقة التركيز مع نفس الإعدادات.

إزالة بعناية فائقة وإعادة تعليق بيليه EV في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب لطيف. تخزين المركبات الكهربائية في أنابيب منخفضة الربط. وتتميز المركبات الكهربائية النقية من قبل غرب النشاف، تحليل تتبع الجسيمات النانوية، والمجهر الإلكترون انتقال.

لوحة 15، 000 MSCs في بئر في لوحة 24 جيدا. بعد 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام القديمة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وتغيير وسائل الاعلام EV المنضب. علاج الخلايا التي تحتوي على نظام التشغيل -EVs في نقاط الوقت المجدولة.

بعد إيقاف العلاج EV، استخراج الحمض النووي من الخلايا باستخدام طريقة مناسبة. لتحليل الميثيل، استخدمنا طريقة تضخيم مسبار مخصص الميثيليشن. صمم مسبار LINE-1 المخصص، كما كان عليه الحال من قبل، من قبل بافيتشي وغيرها.

بالنسبة لمسبارات المثيلات، حدد ثلاثة تسلسلات تحتوي على موقع تقييد HhaI داخل منطقة المروج. بالنسبة إلى تحقيقات التحكم، حدد سبعة تسلسلات تفتقر إلى موقع تقييد HhaI من بقية تسلسل LINE-1. تمييع 70 نانوغرام من عينة الحمض النووي في عازلة TE إلى خمسة ميكرولترات.

سخني العينات لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 98 درجة مئوية ثم تبرد إلى 25 درجة مئوية. إضافة ثلاثة ميكروليترات من مزيج التهجين التحقيق إلى كل عينة وتشغيل ثيرموساير للسماح للتحقيقات إلى التهجين إلى الحمض النووي. في درجة حرارة الغرفة، إضافة 30 ميكرولترات من مزيج ما بعد التهجين لكل عينة.

نقل 10 ميكروليتر إلى أنبوب ثان. ضع كلتا المجموعتين من الأنابيب في الدراجات الحرارية واحتضانها عند درجة حرارة 48 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة على الأقل. في حين أن العينات هي في 48 درجة مئوية، إضافة 10 ميكرولترات من مزيج الربط إلى المجموعة الأولى من الأنابيب و 10 ميكرولترات من مزيج الربط الهضم إلى المجموعة الثانية من الأنابيب.

تشغيل برنامج thermocylcer المقبل. ثم، تدور أسفل الأنابيب وتعيين في وقت واحد من الحرارية إلى 72 درجة مئوية. إضافة خمسة ميكروليترس من مزيج البوليميراز إلى كل أنبوب ووضع الأنابيب في الترموسكلاير.

تشغيل برنامج PCR. أثناء تشغيل برنامج PCR، إعداد حل من formamide ملليلتر واحد يحتوي على 2.5 ميكرولترات من الحجم القياسي. Pipet 10 ميكرولترات من هذا الحل لكل صف من لوحة بصرية 96 جيدا.

بعد PCR، وتمييع العينات غير المهضومة والعينات المهضومة إلى 100 إلى 110 و1 إلى 200، على التوالي في المياه النقية جدا. إضافة اثنين microliters من المنتج PCR المخفف إلى لوحة 96 جيدا. جهاز طرد مركزي في لوحة 200 G لمدة 15 إلى 20 ثانية لإزالة فقاعات الهواء.

إجراء تحليل جزء من العينات بواسطة الكهرباء الشعرية. فتح نتائج الكهرباء الشعرية في برنامج تحليل electropherogram. حدد عينة وتعيين لوحة لMLPA من القائمة.

انقر على لوحة واضغط على السيطرة D لتطبيق هذا الإعداد على جميع العينات. بطريقة مماثلة، قم بتعيين طريقة التحليل إلى سواتل صغيرة افتراضية لكافة العينات. حدد جميع العينات وانقر على زر التشغيل الأخضر لتشغيل التحليل، ثم حدد جميع العينات وانقر على زر الرسم البياني لتصور القمم التحقيق.

تكبير منطقة الذروة للحصول على دقة أعلى من القمم الفردية. تأكد من أن جميع القمم 10 الموافق تحقيقات من المزيج مسبار LINE-1 هي المسمى. في علامة التبويب "الأنماط الجينية"، قم بتصدير النتائج بتنسيق CSV.

افتح ملف CSV في برنامج تحليل بيانات وفرز البيانات في أعمدة. تسمية ثلاثة قمم موقع الميثيل استناداً إلى أحجامها. أما القمم السبع المتبقية فيتطابق مع تحقيقات التحكم.

هنا نحن نستخدم خط 1 2M قمم التحقيق التي لديها حجم ما يقرب من 117 أزواج قاعدة. لكل عينة، حساب مساحة ذروة المجموع من جميع قمم التحكم السبعة. قسم مساحة الذروة لكل مسبار LINE-1 بهذا المجموع.

لكل عينة, تقسيم قيمة العينة هضم على ذلك من العينة غير مهضومة للحصول على نسبة جرعة الميثيل. وأكد التحليل الغربي النشاف وجود نظام التشغيل-المركبات الكهربائية مع إشارات لوحظ لSSG101، HSP70، وD63. ويشير غياب إشارة الكالين إلى أن عينة EV كانت نقية.

لوحظت إشارة إضافية من النقاء مع TEM مع vesicles سليمة من مختلف الأحجام الموجودة في نموذج OS-EV. تم قياس تركيز الجسيمات OS-EV وتوزيع الحجم بواسطة NTA. 80٪ من المركبات الكهربائية كانت في نطاق حجم 50 إلى 200 نانومتر.

هنا يمكننا أن نرى نسب جرعة المثيل من LINE-1 من MSCs في نقاط زمنية مختلفة من العلاج EV. يمثل الخط الرمادي مستوى المثيل الأساسي من نقطة الزمن صفر. في الوقت الثالث، هناك انخفاض في متوسط نسبة جرعة الميثيل بعد إدارة المركبات الكهربائية، مما يدل على hypermethylation.

هذا تأثير فرط الحساسية للمركبات الكهربائية أقل وضوحًا عند النقطة السابعة. هنا أظهرنا تقنية بسيطة وحساسة للغاية وقوية لتحليل المثيلات. وهو يتطلب كمية منخفضة من الحمض النووي مع عدم وجود تحويل ثنائي الفيتيت المعنية، كما أنه مناسب للحمض النووي المعزول عن العينات المضمّنة من البارافين.

الطريقة كلها ، مع الأجزاء التجريبية والتحليلية ، تستغرق حوالي يومين. ونظراً لعدد نسخة عالية من LINE-1 في الجينوم، فإن نموذج خط الخط -1 خط الأساس مرتفع في العينات العادية. ولذلك، فإن الاختلافات في مستويات المثيل من العينات، كما لوحظ مع هذه الطريقة، قد تكون خفية.