نسخ على نطاق التنميط من البروتين RNA التفاعلات من خلال ربط عبر والمناعة بوساطة العلم Biotin تنقية جنبا إلى جنب
May 18th, 2020
هنا نقدم تعديل بروتوكول CLIP-seq يسمى FbioCLIP-eq مع تنقية جنبا إلى جنب العلم biotin لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي من البروتينات RNA ملزمة (RBPs) في خلايا الثدييات.
فقط وفقط البروتينات ملزمة السيطرة على العمليات البيولوجية المتعددة. هذه الطريقة FLAG-Biotin CLIP-seq، وبالتالي لمحة عالمية عن الترتيب الخاص والزمني للرنا رنا و RBPs في خلايا الثدييات. هذه الطريقة تسمح بالكشف الفعال عن الرنا الرنا البروتينية المباشرة دون SDS-PAGE وإجراءات نقل الغشاء.
بالمقارنة مع التقليدية كليب-seq هو النظائر الحرة وأنها لا تتطلب الأجسام المضادة البروتين محددة. تبدأ من خلال طلاء حوالي 3 ملايين الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في لوحة 10 سم واحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة مع فراغ وعلاج الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.25٪ التربسين EDTA لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
إخماد التربسين مع أربعة ملليلترات من المتوسط MESC الطازجة، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. ثم، الطرد المركزي لهم في 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية وإزالة فائقة. تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة ونقلها مرة أخرى إلى لوحة 10 سنتيمترا لربط عبر.
يشع الخلايا بأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر، ثم نقل الخلايا المترابطة إلى أنبوب 15 ملليلتر. تدور أسفل هذه الخلايا في 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية، ثم إزالة supernatant وlyse الخلايا مع 500 ميكرولترات من العازلة A أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات. نقل الخلايا إلى RNAse خالية من 1.5 ملليلتر أنبوب, واحتضان لهم في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
علاج lysate مع 30 ميكرولترات من DNAse 1 في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، وقف رد الفعل عن طريق إضافة أربعة ميكرولترات من 0.5 EDTA الضرس. تدور أسفل بيليه غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 12، 000 مرات G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، ونقل سوبرنات إلى أنبوب جديد المبردة قبل 1.5 ملليلتر.
نقل الخلية إلى الخرز FLAG بعد توازنها، واحتضان العينة في أربع درجات مئوية أثناء تدوير لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الحضانة، الطرد المركزي الخرز لمدة دقيقتين في 3000 مرات G وإزالة عظمى. إضافة 500 ميكرولترات من العازلة A إلى العينة، ومحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم تدور أسفل الخرز وإزالة ناظر.
كرر الغسيل مع Buffer A ، تليها غسولتان مع المخزن المؤقت المبرد B.To مع ثلاث ببتيد FLAG ، وإعداد حل elution كما هو موضح في مخطوطة النص وتدور أسفل حبات FLAG. إزالة supernatant مع طرف ماصة نهاية ضيقة وإضافة 200 ميكرولترات من ثلاثة X FLAG حل elution لكل عينة. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف.
ثم تدور أسفل الخرز لمدة دقيقتين في 3000 مرة G.Transfer supernate إلى أنبوب جديد وتكرار elution مرتين. حفظ 5٪ من الأراضي الممَلَس لتحليل البقعة الغربية أو تلطيخ الفضة للتحقق من كفاءة علم المناعة FLAG. نقل المزائلين المسحوبة إلى الخرز streptavidin المعدة وتدوير العينات بلطف في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها.
ثم، وجمع الخرز على موقف مغناطيسي وإزالة افرا. اغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من Buffer C مع دوران لطيف لمدة خمس دقائق لكل غسل. المقبل، وغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة D، ومرتين مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK العازلة، وجمع الخرز على المنصة المغناطيسية وإزالة supernatant في بين يغسل.
لإجراء الهضم الجزئي للرنا، أضف 100 ميكرولترات من محلول MNA لكل عينة ودوامة مضنية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع خلاط حراري لمدة 10 دقائق. جمع الخرز مع موقف مغناطيسي لمدة 30 ثانية وإزالة supernatant. ثم قم بغسلها بمخزن PNK-EDTA المؤقت، و Buffer C، و PNK buffer وفقاً لتوجيهات المخطوطة.
جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وإزالة العازلة. ثم، إضافة مزيج التفاعل CIP ودوامة الخرز في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة 10 دقائق. سرعان ما يغسل الخرز مرتين مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK EDTA العازلة، تليها اثنين من يغسل مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة PNK العازلة.
بعد يغسل، إضافة 40 ميكروليتر من ثلاثة مزيج ربط الرابط رئيس إلى الخرز، ودوامة لهم في 16 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. إن الربط الفعال بين الرابط والحلفاء أمر بالغ الأهمية لهذه التجربة. تحقق من أنبوب التفاعل في بعض الأحيان للتأكد من أن هذه لا تتعجل أثناء الربط.
بعد الحضانة، كرر يغسل مع PNK EDTA ومخازن PNK، إضافة 40 ميكرولترات من PNK مختلطة إلى الخرز، ودوامة لهم في 37 درجة مئوية مع خلاط الحرارية لمدة 10 دقائق. اغسل الخرز بمخازن PNK EDTA وPNK، ثم تابع مع عزل RNA كما هو موضح في مخطوطة النص. بالمقارنة مع العلم بوساطة أو streptavidin بوساطة خطوة واحدة تنقية التقارب، إزالة تنقية جنبا إلى جنب العلم Biotin-1 تقريبا جميع البروتينات النقية الأساسية، وتجنب تلوث التفاعلات غير المباشرة البروتين RNA.
LIN28 وWDR43، تم تنفيذ Fbio CLIP-seq باستخدام خلايا الماوس الجنينية الجذعية. في المجموع، تم استرجاع حوالي 7.7 مليون و 2.2 مليون قراءة فريدة من نوعها لLIN28 و WDR43 على التوالي. مقارنة بين وجهات النظر المسار تظهر أنماط ملزمة مختلفة في RN45 قبل rrna مكان.
المواقع المترابطة على GGA G عزر من قبل let7 ز RNA من قبل LIN28، FBIO كليب-eq أو التي تم تحديدها. وعلاوة على ذلك، تم تحديد زخارف الحمض النووي الريبي المخصب في مواقع الربط، والنسبة المئوية للنيوكليوتيدات المتحولة في أنواع مختلفة من الطفرات. تبين أن LIN28 يفضل ربط إلى النوكليوتيدات الجينية.
حسنا، في الساعة 10:00 مساء، هذا البروتوكول، من المهم أن نؤكد كفاءة المناعة للتأكد من أن البروتين فقط المجمعات تم تنقيتها بنجاح.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكول CLIP-seq المعدل المسمى Fbio CLIP-seq، والذي يستخدم تنقية FLAG-biotin المتوازية لتحديد أهداف RNA للبروتينات الرابطة لـ RNA (RBPs) في خلايا الثدييات. تسمح الطريقة بالكشف الفعال عن RNA المرتبطة بالبروتينات مباشرة دون الحاجة إلى إجراءات SDS-PAGE ونقل الغشاء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- تلعب البروتينات الرابطة لـ RNA (RBPs) أدوارًا حاسمة في تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة.
- تتطلب طرق CLIP-seq التقليدية غالبًا نظائر محددة وأجسام مضادة خاصة.
- يهدف Fbio CLIP-seq إلى تبسيط عملية تحديد ملامح RBPs وأهدافها من RNA.
- تعد هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة خلايا الثدييات.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة أكثر كفاءة لتحديد أهداف RNA للـ RBPs.
- التخلص من الحاجة إلى إجراءات معقدة مثل SDS-PAGE.
- توفير بروتوكول يمكن تطبيقه بسهولة في دراسات خلايا الثدييات.
الطرق المستخدمة
- زرع خلايا جذعية جنينية فئران في طبق قطره 10 سم.
- حضانة الخلايا بين عشية وضحاها قبل العلاج.
- العلاج بالتريبسين EDTA لفصل الخلايا.
- استخدام تنقية FLAG-biotin المتوازية لعزل RNA.
النتائج الرئيسية
- نجحت طريقة Fbio CLIP-seq في تحديد ملامح RBPs وأهدافها من RNA.
- أظهرت كفاءة في كشف RNA المرتبطة بالبروتينات.
- أظهرت أن الطريقة خالية من النظائر والأجسام المضادة.
- وفرت نهجًا مبسطًا لدراسة تفاعلات RNA-البروتين.
الاستنتاجات
- Fbio CLIP-seq هو أداة قيمة للباحثين الذين يدرسون RBPs في خلايا الثدييات.
- تعزز الطريقة القدرة على تحديد تفاعلات RNA دون القيود التقليدية.
- قد تتسع التطبيقات المستقبلية إلى سياقات بيولوجية وأنواع خلوية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
