التعرف على مستقبلات سطح الخلية باستخدام شاشات CRISPR/Cas9 الجينية على مقياس الجينوم

ولا يزال الكشف عن تفاعلات سطح الخلايا باستخدام النُهج الكيميائية الحيوية المتاحة حالياً يطرح تحديات تقنية. يوفر هذا البروتوكول بديلاً جينياً باستخدام نهج فحص الخلايا على نطاق الجينوم لتحديد تفاعلات ليغاند المستقبلات على سطح الخلية. على عكس معظم الأساليب القائمة الأخرى، هذه الطريقة لا تجعل أي افتراضات بشأن بيولوجيا المستقبلات.

ويوفر فرصاً لتحديد التفاعلات التي تتوسطها مجموعة واسعة من جزيئات سطح الخلايا. جزيئات سطح الخلية يمكن الوصول إليها مباشرة من الأدوية مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة. لذلك ، يمكن أن يكون لتحديد التفاعلات التي تتوسطها هذه الجزيئات آثار علاجية مهمة.

هذه الطريقة قابلة للتطبيق بشكل عام على الباحثين المهتمين باستكشاف عمليات الإشارات الخلوية والتعرف عليها في مجموعة واسعة من السياقات البيولوجية ، بما في ذلك التفاعلات العصبية والمناعية وكذلك التفاعلات المسببة للمسببات المضيفة. يتطلب البروتوكول جهاز فرز خلايا إنتاجية عالية والأجهزة تسلسل الجيل التالي. تأكد من توفر هذه المرافق قبل بدء تشغيل البروتوكول.

تبدأ من خلال جعل ثمانية المخففات التسلسلية من عينات البروتين biotinylated في لوحة 96-جيدا ضمان أن الحجم النهائي لكل تخفيف هو ما لا يقل عن 200 ميكرولترات وأنه يتم تضمين السيطرة على العلامة فقط. جعل لوحة مكررة من العينات عن طريق إزالة 100 ميكروليتر من كل بئر ونقلها إلى لوحة جديدة 96 جيدا. وتشمل السيطرة على البروتين العلامة فقط التي سيتم استخدامها كمسبار السيطرة في جميع المقالات ملزمة.

إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر Streptavidin-PE إلى الآبار في واحدة من لوحات، و 100 ميكرولترات من عازلة التخفيف إلى آبار لوحة أخرى. احتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه، كتلة آبار لوحة streptavidin المشفرة مع العازلة التخفيف لمدة 15 دقيقة.

بعد غسل الصحن، تأكد من أنه جاف. ثم نقل الحجم الإجمالي للعينة من كلا الطبقين إلى آبار فردية من لوحة streptavidin المرمزة واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من عازلة الغسيل.

إضافة 100 ميكرولتررس من الماوس المضادة للجرذ Cd4d3 +4 IgG واحتضان لوحة لمدة ساعة أخرى. كرر الغسلات. أضف 100 ميكرولترات من سففاتوز سفحاتي مضاد للماوس ويترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع عازلة غسل ومرة واحدة مع العازلة التخفيف. إعداد ف-النيتروفينيل الفوسفات في واحد مليغرام لكل ملليلتر في العازلة الإيثانولامين الصبغ وإضافة 100 ميكرولترات لكل بئر. بعد حضانة 15 دقيقة، قياس امتصاص كل بئر في 405 نانومتر.

استخدم الحد الأدنى من التخفيف الذي لا توجد به إشارة على اللوحة كعامل تخفيف مناسب لإنشاء رباعيات. احتضان streptavidin-PE وتخفيف البروتين الحيوي المناسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم تخزين البروتينات المترافقة في أنبوب محمي خفيف في أربع درجات مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

تدور أنابيب المخروطية مع العينات المعالجة والتحكم في 200 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى وتجميد واحد من الأنابيب في ناقص 20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. إعادة تعليق بيليه في أنبوب آخر في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA وتوضع جانبا 100 ميكرولترات من الخلايا كتحكم سلبي على لوحة 96-جيدا.

ثم إضافة البروتين المؤتلف قبل مترافق إلى تعليق الخلية في أنبوب مخروطي وفي لوحة 96-well. أداء تلطيخ الخلية لمدة ساعة واحدة على الأقل في أربع درجات مئوية على الدوار benchtop مع تناوب لطيف. ثم بيليه الخلايا في 200 مرة G لمدة خمس دقائق وإزالة نابيرانت.

بعد غسل الخلايا مرتين ، وإعادة تعليقها في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. سلالة الخلايا من خلال مصفاة 30 ميكرومتر لإزالة مجموعات الخلايا. ثم تحليلها مع سودور تدفق.

استخدام عينة التحكم السلبية إلى بوابة لBFP إيجابية وPE الخلايا السلبية. ثم فرز العينة وجمع 500، 000 إلى 1 مليون BFP إيجابية وPE الخلايا السلبية في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. سوف يتوقف القفص قرحة على ربط الخلايا للبروتين، ولكن عادة واحد إلى 5٪ من العينات السلبية PE يتم جمعها.

الآن السماح للخلايا فرزها عن طريق الطرد المركزي لمدة 500 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم إزالة بعناية فائقة. ويمكن تخزين بيليه في ناقص 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. استخدم دالة العد السحرية لتعيين تسلسلات من السكان غير المفرزة والمصنفة إلى مكتبة المراجع، والتي سوف تسفر عن ملف عدد أولي.

تشغيل وظيفة اختبار السحر باستخدام التهم الخام من عينة التحكم غير فرزها كتحكم والعد من العينة فرز كعلاج. افتح ملف ملخص الجينات الذي تم إنشاؤه ورتب عمود ترتيب الإيقاف المؤقت بترتيب تصاعدي. ثم تحديد يضرب مع معدل اكتشاف كاذبة أقل من نقطة 0.05.

عادة ما يكون في المرتبة مستقبلات في كثير من الأحيان في المركز الأول. وأخيرا استخدام R أو ما يعادلها من البرمجيات لرسم نقاط خوارزمية تصنيف قوية لاختيار إيجابية. تم إجراء شاشات الضربة القاضية مقياس الجينوم لتحديد الشريك الملزم للدمين TNFSF9 وP falciparum أو H5 من TNFSF9 الإنسان وP falciparum Rh5 في NCI-SNU-1 وHC-293 الخلايا على التوالي.

تأثر السلوك الملزم لR5 بكل من كبريتات الهيبان ومن المعروف أنها مستقبلات BSG في حين أن TN-FRSF-9 لم تفقد الربط لمستقبلاتها المعروفة TN-FSF-9. عند ما قبل الحضانة مع الهيبارين القابل للذوبان. وكشف توزيع GNA في مكتبة المتحولين التحكم أن المكتبة المعقدة حافظت طوال فترة التجربة.

تم تقييم الجودة التقنية للشاشات من خلال فحص توزيع التغيرات الطية الملاحظة في G-RNA التي تستهدف مجموعة مرجعية من الجينات غير الأساسية ، مقارنة بتوزيع مجموعة مرجعية من الجينات الأساسية. وبالإضافة إلى ذلك، كشف الإثراء على مستوى المسار أن المسارات الأساسية المتوقعة قد تم تحديدها وإثرائها بشكل كبير في صفوف المتسربين. عند مقارنة عينة التحكم إلى مكتبة بلازميد الأصلي.

توفر خوارزمية الرتب القوية أو RRA-score مقياسًا يتم تصنيف G-RNA باستمرار أعلى من المتوقع. في الشاشة لـ TNFRSF9، كان أعلى ضرب TNFSF9، وهو شريك ملزم معروف. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد عدد من الجينات المتعلقة بمسار TP53.

وفي حالة RH5، بالإضافة إلى المستقبلات المعروفة، وجين اللازمة لإنتاج الكمامات الكبريتية، تم أيضا تحديد الجين SLC16A1. عادة ما يكون نهج الفحص قويًا جدًا وينبغي أن يكون مستقبلات التفاعل المباشر في مرتبة عالية في قائمة الجينات التي يتم إثراؤها في هذا الترتيب السكاني. من المهم التحقق من صحة الزيارات التي تم الحصول عليها من الشاشة.

إذا تم التوسط التفاعل من قبل البروتينات، يمكن استخدام النهج الكيميائية الحيوية المصممة لدراسة التفاعلات البروتين البروتينية الثنائية، على سبيل المثال، لمزيد من الدراسات التحقق من الصحة. وبسبب طبيعة مقياس الجينوم غير المتحيز لهذا النهج، نتوقع أنه سيساعد في استكشاف التفاعلات التي يتوسطها من الصعب دراسة جزيئات الخلايا مثل الدهون وبروينات الأغشية المتعددة التمريرات والجليسانات. كما قد يكشف عن مسارات جديدة مطلوبة للاتجار بالمستقبلات والبيولوجيا.