إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية توفر منصة متعددة لدراسة أصول الحياة، فضلا عن العلاجات الاصطناعية القائمة على الخلايا للتسليم الدوائي المتقدمة. هذه الطريقة بسيطة وبأسعار معقولة لرنا والتعبير البروتين ويمكن تطبيقها على إنتاج البروتين العلاجي في الموقع مباشرة داخل الجسم. ويمكن استخدام هذه الأنظمة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض من أمراض التمثيل الغذائي وبدائل البروتين إلى السرطان وربما مرض السكري.

يحتوي هذا البروتوكول متعدد الخطوات على نقطة إيقاف معرّفة. عند تنفيذها لأول مرة ، يوصى بتقسيم العمل على عدة أيام. بروتوكول لإنتاج الخلايا الاصطناعية يبدأ مع إعداد الخلية الخالية من S30-T7 lysate.

بعد ذلك، يتم إعداد الدهون الغشاء والمحلول الغذائي الخلوي لمحاكاة البيئة الداخلية ودعم إنتاج البروتين. الخطوة الأخيرة هي إعداد الخلايا الاصطناعية نفسها. إعداد الثقافات بداية مكررة في 100 ملليلتر قارورة Erlenmeyer.

إلى كل قارورة، إضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB تكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين وتطعيم مع مستعمرة الإشريكية القولونية واحدة. تنمو الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة الكلمة شاكر في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. المقبل, إعداد اثنين لتر حيرة قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على 500 ملليلتر من وسائل الإعلام السل تكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من أمبيسيلين.

تلقيح كل قارورة لترين مع ثقافة بداية خمسة ملليلتر. ضع القارورة في شاكر عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. مراقبة الثقافات بشكل دوري باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتنمو الثقافات حتى OD600 بين 0.8 وواحد.

للحث T7 RNA RNA التعبير البوليميراز، إضافة إلى كل قارورة ثلاثة ملليلتر من 100 ملليمولار IPTG للوصول إلى 0.6 ملليمولار. مواصلة نمو الثقافات حتى OD600 هو ما يقرب من أربعة. بعد أن تصل الثقافات إلى الكثافة البصرية المطلوبة، قم بنقل التعليق من كل قارورة إرلينماير إلى أنبوبين للطرد المركزي معقمة 250 ملليلتر.

أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 7،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل المُندفع. Resuspend كل بيليه في 250 ملليلتر من S30 الباردة lysate العازلة باستخدام مُحرك إذا رغبت في ذلك.

جهاز طرد مركزي في 7،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل عظمى وإعادة تعليق جميع الكريات معا في 15 ملليلتر من S30 الباردة العازلة lysate. تصفية التعليق باستخدام منصات الشاش.

قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، precool النصائح في 1.5 قوارير ملليلتر التي ستكون هناك حاجة لتخزين lysate. التجانس تعليق مرتين. استخدام ضغط العمل من 15،000 PSI مع ضغط الهواء من أربعة شريط لكسر الخلية.

جمع التجانس. إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 داتر مول لكل 10 ملليلتر من تعليق متجانسة. الطرد المركزي تعليق في 24،700 مرات ز في 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.

ويصنف كل من DTT والكلوروفورم على أن هما مهيجين وضارين، ولذلك ينبغي التعامل مع كل من هذه المواد بعناية. يجب استخدام الكلوروفورم المستخدم لاحقًا في البروتوكول في منطقة مع استخراج الدخان. للحفاظ على نشاط lysate، قم بتنفيذ الخطوة بسرعة.

ضع 200 ميكرولتر aliquots من اغرات في قارورة ما قبل التبريد وال المفاجئة تجميدها على الفور مع النيتروجين السائل. تخزين قارورة في درجة مئوية سلبية 80 لاستخدامها في المستقبل. بشكل منفصل حل POPC والكوليسترول في كل من الكلوروفورم إلى تركيز نهائي من 100 ملليغرام لكل ملليلتر.

دوامة كل قارورة على حدة. الجمع بين المكونات في قارورة زجاجية مليلتر اثنين. إضافة 50 ميكرولترات من محلول الكوليسترول الكلوروفورم، 50 ميكرولترات من حل الكلوروفورم POPC، و 500 ميكرولترات من الزيوت المعدنية.

دوامة القارورة، ثم لتبخر الكلوروفورم، تسخينه لمدة ساعة واحدة في 80 درجة مئوية في غطاء محرك السيارة الكيميائية. قبل البدء في مرحلة إنتاج الخلايا الاصطناعية، قم بإعداد حلول التغذية الخارجية، و ما قبل الداخلية، كما هو موضح في المخطوطة. ثم ضع 1.2 ملليلتر من المحلول الخارجي في أنبوب 15 ملليلتر وأضف ببطء طبقة من 500 ميكرولترات من محلول الدهون في الزيت من قارورة الزجاج الأولى.

احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. لوضع اللمسات الأخيرة على إعداد الحل الداخلي، مزيج على الجليد إلى حجم النهائي من 100 ميكرولترات بإضافة S30-T7 lysate والحمض النووي plasmid. إضافة 100 ميكرولترات من المحلول الداخلي مع lysate وplsmid إلى الثانية اثنين من المليلتر الزجاج قارورة مع 500 ميكرولترات من الدهون في حل النفط.

الماصة صعودا وهبوطا بقوة لمدة دقيقة واحدة ثم دوامة لمدة دقيقة أخرى على المستوى الخامس. بعد احتضان المستحلب الناتج لمدة 10 دقائق على الجليد المسحوق ، أضف ببطء المستحلب على قمة مرحلة الزيت في أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق في 100 مرة ز وأربع درجات مئوية.

ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 400 مرة ز وأربع درجات مئوية. بحلول نهاية الطرد المركزي ، يجب أن تكون الكريه ملحوظة في الجزء السفلي من الأنبوب. لاستخراج بيليه، أولا إزالة طبقة النفط الزائدة.

بعد ذلك، قم بتحميل طرف ماصة مشذبة مع حوالي 400 ميكرولترات من المحلول الخارجي واستخدم طرف الماصات لجمع البيليت، والإفراج عن الحل الخارجي مع مرور طرف الماصات عبر مرحلة النفط. مسح تلميح ماصة ونقل بيليه إلى أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة. الطرد المركزي بيليه لمدة 10 دقائق في 1،000 مرات ز وأربع درجات مئوية.

إزالة عظمى و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من محلول التغذية. للتعبير عن البروتين، احتضان تعليق لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية دون اهتزاز. Plasmids التعبير عن البروتين النموذجي sfGFP ورينيلا luciferase أدخلت في تخليق البروتين خالية من الخلايا, ردود الفعل السائبة CFPS, والخلايا الاصطناعية.

تم تقييم إنتاج البروتين باستخدام عدة طرق. كشف تحليل البقعة الغربية sfGFP His6 الإنتاج في كل من ردود الفعل السائبة CFPS وداخل الخلايا الاصطناعية. تم استخدام sfGFP تنقية His6 كتحكم إيجابي.

مجهر الفلورسنت مع برايتفيلد ومرشح GFP تظهر الخلايا الاصطناعية التي تنتج sfGFP. تم استخدام عملية استئصال الخلايا في التدفق لتحليل إنتاج الخلايا الاصطناعية sfGFP. واستند حساب مجموعة الخلايا الاصطناعية النشطة إلى عتبة كثافة الفلورية sfGFP التي تحددها عينة الحمض النووي السلبية التي يمثلها الرسم البياني الأحمر.

تم حساب متوسط كثافة الفلوراس من sfGFP إنتاج الخلايا الاصطناعية من السكان الخلايا الاصطناعية النشطة وتطبيعها إلى عينة الحمض النووي السلبية. تم حساب توزيعات القطر للخلايا الاصطناعية النشطة على أساس إشارة sfGFP. تم قياس نشاط رينيلا لوسيفيراز كمياً بقياسات الإنارة.

هذه الطريقة هي تنوعا للغاية ويمكن تحسينها للبروتينات المستهدفة المختلفة عن طريق تغيير الأصل lysate, تكوين الدهون وتركيزات الحل الداخلي. ويمكن إجراء تحليل FACS للخلايا الاصطناعية التي تنتج بروتيناً للعلامة الفلورية لتوفير القيمة الكمية لجزء الخلايا الاصطناعية النشطة. تحليل البقعة الغربية من شأنه أن يقيس إنتاج البروتين.