توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ
مايو 16, 2020
هنا هو إجراء متدرج لتمايز في المختبر من keratinocytes الإنسان الأولية عن طريق تثبيط الاتصال تليها توصيف على المستوى الجزيئي من قبل تحليل الحمض النووي الريبي- seq.
في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء يحتوي على جزأين. أولا, أحادية الطبقات 2D keratinocyte طريقة التمايز في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال. ثانيا ، توصيفها الجزيئي من قبل RNA - seq.
طريقة التمايز 2D في المختبر واضحة وسهلة الأداء. ويمكن استخدامه لدراسة التمايز البشرة، وخصوصا عندما يكون هناك عدد كبير من الخلايا اللازمة. على سبيل المثال، في التحليل الجينومي.
خط أنابيب تحليل RNA-seq مفصلة واضحة وشفافة للباحثين ذوي المهارات الأساسية المعلوماتية الحيوية، ويمكن استخدامه لأي تحليل RNA-seq السائبة. عند تنفيذ بروتوكول التمايز لأول مرة، نضع في اعتبارنا أن كثافة البذر يمكن أن تكون صعبة. جرب كثافة البذر المتعددة لمعرفة أي واحد يعمل بشكل أفضل مع خط الخلية.
تبدأ من خلال إعداد متوسط نمو الكيراتينوسيتي أو KGM و 500 ملليلتر لكل من متوسط الانتشار والتمايز المتوسط وفقا لاتجاهات المخطوطات. بذور keratinocytes الأولية في كثافة من 5 إلى 20، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع وإضافة ما يكفي من وسائل الانتشار لتغطية الخلايا. بعد يومين من البذر، تحديث الخلايا مع وسيلة الانتشار.
تحقق من الخلايا بانتظام تحت المجهر وتحديث المتوسطة كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء، تحث على التمايز عن طريق تغيير الوسط إلى وسيط التمايز. لجمع الخلايا لمزيد من التحليلات RNA، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS ومن ثم إضافة العازلة تحلل.
جمع الخلايا في أيام التمايز صفر، اثنين، أربعة، وسبعة. بعد عزل الحمض النووي الريبي، سيتم تحويل cDNA المزدوجة التي تقطعت بها السبل وسيتم إعداد مكتبات الحمض النووي الريبي -seq لتسلسل الجيل القادم. بعد التسلسل، سيتم تحميل قراءة تسلسل وتعيين الجينوم البشري.
بعد تحميل وتثبيت حزم R، إنشاء جدول حساب من readspergene.out. ملفات التبويب وكتابة نموذج ملف البيانات التي تحتوي على كافة أسماء الملفات، يوم التمايز وغيرها من البيانات ذات الصلة. راجع ملفات الترميز التكميلية للحصول على مثال.
ثم استخدم جدول العدد و عينات البيانات لإنشاء كائن deseq2 يحتوي على كل من بيانات قابل للعد و عينة. للتطبيع التعبير الجيني، تطبيع جدول العد في deseq2 الكائن باستخدام إما deseq2RLD أو التطبيع VST. بينما يفضل التطبيع RLD، التطبيع VST هو أسرع بكثير.
استخدم دالة dist في R لرسم مسافة العينة استناداً إلى كثافة عدد القراءة التي تم تسويتها، ثم قم بتنفيذ تجميع hclust استناداً إلى مسافة العينة. بعد ذلك، رسم خريطة الحرارة باستخدام وظيفة فياتاب. وأخيراً، قم بإنشاء تحليل مكون أساسي أو مؤامرة PCA من كثافة عدد القراءة تطبيع باستخدام الدالة plotPCA deseq2.
يعمل PCA كأداة في تحليل البيانات الاستكشافية ويمكن استخدامه لتصور المسافة والاتصال بين العينات المختلفة. إجراء تحليل التعبير الجيني متغير للغاية مع وظيفة rowVars التي تستخرج أعلى 500 الجينات متغير للغاية عن طريق ترتيب على التباين بين العينات من نقاط زمنية مختلفة. هذه الجينات لديها أعلى انحراف معياري من كثافتها تطبيع عبر أيام من التمايز.
تنفيذ k-يعني التجمع على الجينات متغيرة للغاية لتجميع لهم أنماط التعبير المختلفة. تصور الجينات في خريطة الحرارة مع حزمة فياتاب. الكثافة المرسومة في خريطة الحرارة هي كثافة deseq2 تطبيع مع القيمة الوسيطة المطروحة.
إنشاء قائمة من الجينات الخلفية أعرب عن ذلك التي تشمل جميع الجينات مع أكثر من 10 العد في عينة واحدة وجعل قائمة مع الجينات من كل مجموعة. وأخيراً، قم بإجراء تحليل علم الولوج الجيني باستخدام GOrilla. استخدام قائمة الجينات الخلفية ومجموعة الخلفية وقائمة الجينات المتغيرة للغاية في مجموعات كما مجموعة الهدف، ثم انقر على البحث المخصب المصطلحات GO.
بدلاً من ذلك، يمكن للمستخدمين R أكثر تقدماً استخدام حزمة مجموعةProfiler لأتمتة تحليل الإثراء المصطلح GO. واستخدمت خطوط الكيراتينوسيت المستمدة من خمسة أفراد للتمايز في تحليلات الحمض النووي الريبي-الصد. أظهر تحليل المكون الرئيسي أن الكيراتينوسيات التي تمر بالتمايز كانت مرتبطة ولكن ملامح التعبير الجيني العام المتميزة.
وتجمّهرت الجينات الشديدة التباين لتصور ديناميات التعبير الجيني وأنماطه أثناء التمايز. كل مجموعة من الجينات ممثلة الجينات الوراثية التمييز keratinocyte السمة المميزة واظهار الجينات Ontology شرح اختلاف واضح في وظائف الجينات. في التجربة الثانية، تمت مقارنة الاختلافات في مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني بين خلايا الكيراتينوس من الضوابط الصحية وخطوط الخلايا المشتقة من المرضى الذين يحملون طفرات P63.
وأظهر تحليل المكونات الرئيسية أن خطوط الخلايا التحكمية تتبع بوضوح نمطاً من التمايز، ولكن نمط التعبير الجيني للخلايا المتحولة أثناء التمايز يبقى مشابهاً إلى حد كبير لنمط الخلايا المتكاثرة أو غير المتمايزة. في تحليل التجمع، كانت الجينات في المجموعة الأولى من المواد الهابطة في خلايا التحكم ونزلت جزئيا في الخلايا المريضة التي تحمل طفرات R204W وR279H، ولكن ظلت عالية في الخلايا التي تحمل R304W. هذه الجينات من المرجح أن تلعب أدوارا في انتشار الخلايا كما يتضح من تحليل علم التناطولوجيا الجينية.
تم إدخال جينات المجموعة الثانية لأول مرة وبالتالي الضوابط الهانائية في خلايا التحكم. ومن المرجح أن تشارك هذه الجينات في تمايز الكيراتينوسيت كما تم إثراء التمايز الجلد ووظائف الكيراتين للغاية لهذه المجموعة. تم حث الجينات في المجموعة الثالثة فقط في نهاية التمايز في خلايا التحكم مما يشير إلى أنها قد تلعب دورًا في الطبقة الخارجية من البشرة.
عند تحليل بيانات RNA-seq، من المهم أن نعرف مسبقا ما يمكن توقعه. هذا سوف تساعدك على حد سواء مع تفسير مراقبة الجودة ومؤامرة PCA وفي تقييم ما إذا كانت النتائج الخاصة بك هي معنى. يمكن استخدام أساليبنا لدراسة النسخ الجيني سواء في علم الأحياء البشرة وكذلك في النظم البيولوجية الأخرى.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة إجراءً تدريجيًا لتمييز الكيراتينوسيتات البشرية الأولية في المختبر من خلال تثبيط التلامس، متبوعًا بالتوصيف الجزيئي باستخدام تحليل RNA-seq.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الجينوم
الخلفية
- الكيراتينوسيتات ضرورية للتمايز البشري.
- فهم تمايزها مهم لبيولوجيا الجلد.
- يوفر RNA-seq رؤى حول ملفات تعريف التعبير الجيني.
- تثبيط التلامس هو آلية رئيسية في تمايز الخلايا.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لتمايز الكيراتينوسيتات في المختبر.
- توصيف التغييرات الجزيئية أثناء التمايز.
- تسهيل الدراسات في بيولوجيا البشرة والمجالات ذات الصلة.
الطرق المستخدمة
- زراعة الكيراتينوسيتات البشرية الأولية في المختبر.
- تحريض التمايز من خلال تثبيط التلامس.
- تحليل RNA-seq للتوصيف الجزيئي.
- تقييم تغييرات التعبير الجيني أثناء التمايز.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق التمايز الناجح للكيراتينوسيتات.
- تم تحديد ملفات تعريف التعبير الجيني المميزة عبر RNA-seq.
- تثبيط التلامس يحفز التمايز بشكل فعال.
- الطريقة مناسبة للدراسات واسعة النطاق.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول نهجًا مباشرًا لتمايز الكيراتينوسيتات.
- يكشف تحليل RNA-seq عن رؤى جزيئية مهمة.
- يمكن أن تتقدم هذه الطريقة البحث في بيولوجيا الجلد وعلم الجينوم الفوقي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Robust in vitro differentiation and RNA-seq profiling of human primary keratinocytes provide a scalable platform for dissecting epidermal biology and disease mechanisms. This workflow enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, supporting translational continuity for dermatological and epithelial research portfolios. The approach facilitates quantitative, reproducible molecular characterization essential for early-stage decision-making in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of differentiation pathways and gene regulatory networks in human keratinocytes.
- Supports functional target validation by linking gene expression dynamics to phenotypic outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets implicated in epidermal disorders.
- Provides a quantitative framework for portfolio triage based on molecular signatures.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible 2D keratinocyte differentiation systems for downstream assays.
- Delivers standardized RNA-seq outputs for benchmarking compound or genetic perturbation effects.
- Enables high-throughput readiness for screening gene expression modulators in disease-relevant contexts.
- Supports platform reuse across multiple cell lines and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro gene expression patterns with in vivo epidermal stratification for translational relevance.
- Enables comparative analysis of healthy versus disease-mutant keratinocytes for biomarker discovery.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with validated differentiation phenotypes.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene expression analysis and functional validation in human keratinocytes.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification through quantitative transcriptomic profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs such as PCA, clustering, and GO enrichment to compare differentiation states and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant biology by modeling patient-derived mutations and phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable workflow adaptable to diverse keratinocyte lines and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes differentiation and RNA-seq analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early molecular de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatology and epithelial biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA-seq library preparation, and bioinformatics analysis.
- Needs access to next-generation sequencing platforms and computational infrastructure for data processing.
- Demands cross-team standardization of seeding density, differentiation timing, and data normalization.
- Adaptable to various keratinocyte lines and patient-derived models with protocol optimization.
- Dependent on robust quality control and statistical analysis to ensure data interpretability.
