ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

مع TRAP، يمكننا التحقيق في المعالجة التنموية بدقة خلوية. نستخدم المروجين من نوع الخلية لقيادة وحدة فرعية الريبوسومية الموسومة ، ومن هناك يمكننا عزل الحمض النووي الريبي المتعدد. هذا البروتوكول ينتج RNA عالية الجودة ، ولكن بكميات محدودة للغاية ، لذلك ، هناك حاجة إلى الأساليب المتخصصة في المدخلات المنخفضة للغاية لإنتاج مكتبات RNA عالية الجودة بشكل موثوق.

TRAP هو أداة مثالية للبحوث النباتية، لأن العديد من العمليات التنموية تعتمد على مسارات الإشارة الميكانيكية المتعلقة بجدار الخلية. نحن نستخدم TRAP لدراسة خلية اتصال الخلية في تشكيل الجذر الجانبي. كما ثبت الحصول على نوعية جيدة RNA ليس على التوالي إلى الأمام كما كنا نتوقع، ونحن نأمل أن هذا التعليم الفيديو خطوة بخطوة سوف تزيد من تطبيق TRAP وتساعد على تعزيز هذه التقنية القوية.

لتعقيم خطوط homozygous نشر، ونشر أقل من 300 ميكرولتر من البذور بالتساوي على 12 في 12 سم مربع أطباق بيتري، وكومة الأطباق على 60 لتر desiccator. بعد تعقيم الغاز بين عشية وضحاها، والسماح للغاز يتبخر قبل جمع البذور في أنبوب تخزين 50 ملليلتر. قبل الطلاء، تمييع البذور المعقمة مع 0.1٪ أجار للحصول على ملليلتر واحد من مزيج البذور الممدودة لكل لوحة.

لطبقة مزيج البذور، استخدم أغطية طبق بيتري مربعة لإنشاء حامل قالب مغلفة لغرس ثلاثة صفوف من البذور لكل لوحة، ووضع لوحات أجار فارغة في حامل القالب. توزيع ملليلتر واحد من البذور imbibed بالتساوي على ثلاثة صفوف من لوحات. ووضع لوحات معالجتها في أكوام في تدفق لارينار، حتى البذور جافة.

عندما تلتصق البذور بسطح أجار، أغلق الأغطية وختم كل لوحة بشريط ميكروبور. لعلاج خارجي من جذور arabidopsis مع عامل من الفائدة ، وإعداد 1.5 إلى اثنين من سنتيمتر واسعة ، 10 سنتيمترا ، شرائط من ورق الأنسجة. نقع ورقة الأنسجة في 10 naa micromolar، واستخدام ملاقط لتطبيق شريط من الورق الأنسجة على كل صف من الجذور.

ثم، اضغط بلطف خارج أي فقاعات الهواء، وإفراغ السائل الزائد من لوحة، قبل وضع علامة على لوحة مع الوقت. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم ملقط لإزالة شرائح الورق من الأنسجة بعناية من كل لوحة دون فصل الجذور، واستخدم شفرة جراحية لقطع مرة واحدة في الصف على طول تقاطع جذر التصوير، في ضربة واحدة محددة. استخدام ملاقط لانتقاد على طول جذور كل صف، لجمع جذور في ثلاث حزم.

وتفرغ الجذور إلى أنبوب 50 ملليلتر مملوء بالنيتروجين السائل، لتجميد المفاجئة. عندما تم جمع كل من عينات الجذر لكل علاج، decant النيتروجين السائل الزائد باستخدام غطاء أنبوب لمنع الجذور من الانسكاب. ووضع الأنبوب في وعاء doer، لتخزين 80 درجة مئوية.

لطحن الأنسجة والتجانس، وارتداء قفازات القطن تحت قفازات مختبر القياسية، وإضافة PMSF إلى العازلة استخراج متعددةsome. إفراغ عينة الأنسجة في هاون يحتوي على النيتروجين السائل، واستخدام آفة المبردة لطحن بعناية الأنسجة حتى تظهر جميع المواد كمسحوق أبيض. عندما تم كل من الأنسجة الأرض، إضافة خمسة ملليلتر من العازلة استخراج متعددة إلى العينة، وخلط بسرعة شظايا الأنسجة المجمدة مع مسحوق قبل تجميد العازلة.

بمجرد أن يمكن نقل الخليط ، إفراغ الطين إلى مزج الزجاج على الجليد ، واستخدام مليلترين إضافيين من العازلة استخراج متعددة التخصصات لشطف هاون وحشرات. طحن الطين يدويا حتى استخراج متجانسة. ثم، صب استخراج الجذر الخام في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر على الجليد، ومعالجة العينة التالية كما هو موضح.

بالنسبة لمجموع جمع الحمض النووي الريبي، قم بنقل 200 من جمل ميكرولتر من كل عينة خام إلى أنابيب فردية نظيفة سابقة التبريد تحمل اسم microcentrifuge. لإزالة جدران الخلايا، والحطام، والعضيات الكبيرة، الطرد المركزي العينات وdeconant إلى أنابيب مخروطية جديدة، قبل التبريد للطرد المركزي الثاني. في حين أن الأنابيب تدور، aliquot 60 ميكرولتر من الخرز GFP المغناطيسي لكل عينة، في أنبوب 1.5 ملليلتر.

ووضع الأنبوب على موقف مغناطيسي، لتسهيل إزالة فائقة. ثم، وغسل الخرز مرتين في ملليلتر واحد من غسل الباردة العازلة في غسل، وإعادة تعليق الخرز في 60 ميكروليتر من المخزن المؤقت غسل لكل عينة. مباشرة بعد الطرد المركزي، ديسابيرت مسح في أنابيب 15 ملليلتر المسمى، وإضافة 60 ميكرولترات من الخرز غسلها إلى كل عينة.

ثم، ضع كل العينات أفقيا في دلو الثلج، لمدة ساعتين حضانة مع هزاز. في نهاية الحضانة، وجمع الخرز على موقف مغناطيسي على الجليد، وإضافة PMSF إلى العازلة استخراج البوليسوم المتبقية. بعد التخلص من المابات، إضافة ما يقرب من خمسة ملليلترات من العازلة استخراج متعددة إلى العينات، وإعادة تعليق الخرز داخل العينات مع إمالة لطيف.

صخرة العينات لمدة 15 دقيقة على شاكر على الجليد، تليها اثنين من يغسل مع عازلة غسل الطازجة على المغناطيس، كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، قم بنقل العينات في ملليلتر واحد من عازلة الغسيل، إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. وجمع الخرز مرة أخرى على موقف المغناطيسي، لإزالة كل من افرا.

ثم ضع الأنابيب على الجليد حتى تتم معالجة جميع العينات. لإعادة تجهيز اللوازم المعملية، أولاً، شطف جميع المعدات في النفايات الكيميائية. غسل اليد قذائف الهاون، الأوبئة، والمجانسة مع الصابون، قبل شطف كل صك بدقة.

بعد ذلك، ضع المعدات في حاوية آمنة من الحرارة، واخبز المواد بين عشية وضحاها في أكثر من 220 درجة مئوية. فرشاة جميع أنابيب الطرد المركزي نظيفة مع المنظفات، قبل وضع الأنابيب على علبة قابلة لأتمتة مع حافة وغطاء الدخان. صب ملليلتر واحد من بيريوكاربوينت دييثيل السائل واحد لتر من محلول المياه ديونيد على الأنابيب لمدة ثلاث إلى 18 ساعة.

ثم، وجمع الحل قبل تعقيم صينية من الأنابيب في الأوتوكلاف. هنا، تظهر النباتات التمثيلية مع إشارات GFP. مضادة تلطيخ مع يوديد بروبديسيوم علامات على حدود جدار الخلية.

وتتوافق الخطوط مع نمط التعريب للـ endodermis، و pericycle xylem-pole. في هذه القياسات التمثيلية التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي المتعدد، أظهرت معظم العينات تدهورًا ضئيلًا جدًا، حيث تراوحت أعداد تكامل الحمض النووي الريبي بين تسعة إلى 10. في هذه الرسوم البيانية، يمكن ملاحظة آثار المكتبات المعدة بنجاح، مع تسليط الضوء على قوة الإجراء، على الرغم من حجم التفاعل المُتدرج.

قبل إنتاج مجموعة بيانات الجينوم تمتد، TRAP RNA من تجربة تجريبية يمكن أن يكون التحقيق بواسطة رتبر كمي للتحقق من نجاح العلاج و / أو الظروف التجريبية، فضلا عن خصوصية الأنسجة. في هذا التحليل، أكد اختبار ثلاث جينات تستجيب لـ أوشين نجاح تحريض الهرمونات بعد ساعتين من العلاج. وأكدت الملامح الجينية الخاصة بالأنسجة التي تم استردادها من بيانات التسلسل خصوصية نوع الخلية.

اتبع نصيحة الممارسة الجيدة عند التعامل مع الحمض النووي الريبي. العمل في مقاعد البدلاء العقيمة، وتنظيف المعدات الخاصة بك مع الحمض النووي الريبي إزالة الحل، وارتداء القفازات وتغييرها على الفور عندما تحصل ملوثة. تأكد من التعامل مع المواد الكيميائية والغازات السامة التي تم استخدامها أثناء الإجراء والتخلص منها بشكل مناسب، وخاصة غاز الكلور الفينول-DEPC والنيتروجين السائل.

في محفظة الدراسات أوموميك، TRAP تحتل مكانة هامة، وقد استخدمت بالفعل للإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية، وخاصة في علم الأحياء التنموية، TRAP لديه إمكانات ضخمة.