مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva
مايو 17, 2020
هنا هو منصة مجهرية متعددة الصور للتصوير حية سطح العين الماوس. الماوس الفلوري المحورة تمكن من تصور نواة الخلية، أغشية الخلية، والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. توفر إشارات الجيل التوافقي الثاني غير الخطي المشتقة من الهياكل الكولاجينية تصويرًا خاليًا من التسمية لبنيات ال stromal.
يستخدم هذا البروتوكول مجهر متعدد التصفية للتصوير الحي للهيكل الكامل لسطح العين الماوس في نموذج الماوس الفلوري المزدوج المعدلة وراثيا. إن الجمع بين منصة مجهرية متعددة الصور مخصصة وفئران ثنائية محورة وراثيا للفلورسنت تمكن من التصور في الوقت الحقيقي لسطح العين وبنيته. لإعداد المجهر متعدد الصور، حدد غمر الماء 20X، 1.00 NA الهدف وتعيين ليزر التيتانيوم الياقوت كمصدر الإثارة على المجهر تستقيم.
تعيين الطول الموجي خرج الليزر إلى 880 نانومتر لEGFP و 940 نانومتر ل tdTomato. وتشمل اثنين من المرايا dichroic لفصل SHG EGFP وGFP tdTomato واستخدام 434-17، 510-84 و 585-40 نانومتر تمرير الفرقة المرشحات لفصل الطيفي إشارات EGFP وSdTomato. لإعداد حامل العين ، بعد التأكد من عدم الاستجابة لدواسة منعكس في تخدير 8-12 ماوس من العمر أسبوع ، ضع الماوس على مرحلة المجهر ساخنة وإدراج مسبار مراقبة درجة الحرارة.
ضع الماوس في حامل فأر مجسم مخصص وأدخل قضبان الأذن في اللحم السمعي الخارجي. استخدام ثلاث نقاط التثبيت لتأمين حامل الرأس وتطبيق 0.4٪ هيدروكلوريد أوكسيبوكوكاين والمحلول الملحي على سطح العين. تغطية نصائح من زوج من عدد خمسة دومون ملقط مع حلقة أنبوب PE.
بعد ثلاث دقائق إجراء تراجع الجفن اليدوي لتأكيد نتوء مقلة العين ووضع بعناية حلقة أنبوب حامل PE على طول هامش الجفن لفضح سطح العين. واستخدام مقبض الباب من حامل لتحقيق الاستقرار في مقلة العين مع ملقط. ثم، تغطية سطح القرنية مع هلام العين مع مؤشر الانكسار من 1.338.
بالنسبة للتصوير التسلسلي Z لسطح القرنية، استخدم مصدر ضوء الزئبق لتصوير حقل الاستهداف وفتح برنامج المجهر. حدد مضاعف الصورة المناسبة والمكاسب الرقمية لتصور بنية الخلوية في سطح العين وتعيين الشريحة الأولى والأخيرة للسماح بالحصول على كومة صورة. تعيين دقة الصورة إلى 512 في 512 بكسل و خطوة Z إلى ميكرومتر واحد.
ثم انقر فوق ابدأ لجمع Z الصور التسلسلية الحصول على صورة حية واحدة مع 880 نانومتر الإثارة لجمع إشارة EGFP SHG، وصورة حية واحدة في 940 نانمتر الإثارة لجمع إشارة EGFP tdTomato داخل كل منطقة. في جميع أنحاء الصورة، استخدم حامل المرحلة السائرة الآلية لتدوير مقلة العين للسماح بالتصوير عبر سطح القرنية بأكمله. عندما تم الحصول على جميع الصور، قم بتحميل الصور التسلسلية Z في فيجي وحدد البرنامج المساعد Median 3D filter.
بعد إزالة الضوضاء الخلفية، حدد حزمة تصفية قناع unsharp فيجي لشحذ الصور وانقر على النقيض سطوع السيارات لتحسين جودة الصور تلقائيا. بعد المعالجة، حفظ الصور كتسلسل صورة تسلسلي وتصدير تسلسل الصورة إلى برنامج إعادة الإعمار 3D المناسبة. في جميع الصور المجهرية متعددة الصور، تقديم إشارات EGFP tdTomato و SHG باللونين الأخضر الزائف والأحمر السماوي على التوالي قبل التقاط صور الهيكل ثلاثي الأبعاد بواسطة لقطة.
يسمح المجهر متعدد الصور بالتصور من الجناح السطحي والخلايا القاعدية في ظهارة القرنية للفئران المعدلة وراثيا الفلورية المزدوجة. يمكن تعيين خلايا واحدة من الطبقة القاعدية إلى الطبقة السطحية وكذلك خلايا سطحية واحدة سداسية الشكل. كما كشفت عن ذلك التعبير السيتوبلازمي لإشارة tdTomato ، فإن نظام الغشاء الغني بالبروتين داخل الخلايا ، بما في ذلك جهاز golgi و endoplasmic الشبكية متناثر داخل الخلايا الجناحية.
ضمن ستروما collagenous، وترد على شكل ممتاز coratesites من قبل الغشاء استهداف الفلورسنتين EGFP في هذه الفئران. وcoratesites جزءا لا يتجزأ من ستروما الكلية هي أكثر متباعدة فضفاضة من داخل الخلايا البطانية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن يتصور الأعصاب المتفرعة رقيقة داخل ستروما القرنية من قبل غشاء استهداف إشارات tdTomato و monolays الخلايا البطانية القرنية تظهر شكل سداسية متجانسة نسبيا متصلة في نمط العسل.
يتكون ظهارة الـ Limbal من طبقة إلى طبقتين من الخلايا الظهارية. كما تمكن السلالة المعدلة وراثياً من الفلورسنت المزدوجة من تصوير الشعيرات الدموية داخل الملتحمة، مما يسهل إعادة بناء العمارة ثلاثية الأبعاد للريش الدموية التي تحدد بطانة الأوعية الدموية. استقرار مقلة العين مع الضغط المعتدل دون إصابة أمر بالغ الأهمية للحصول على صور ذات نوعية جيدة كما ضغط غير كاف أو المفرط يمكن أن يعرض للخطر جودة الصورة.
يمكن تعديل هذه المنصة تصوير الصور NVivo للتصور من الهياكل تحت سطح العين ويمكن تطبيقها على الدراسات في الموقع من مختلف الأمراض العيون.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة منصة مجهرية متعددة الفوتونات للتصوير الحي لسطح العين لدى الفأر باستخدام نموذج فأر معدل وراثياً مزدوج الفلورسنت. يتيح هذا النظام التصوير الفوري لمختلف البنى الخلوية داخل سطح العين.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- طب العيون
- المجهرية
خلفية علمية
- يعد المجهر متعدد الفوتونات تقنية تصوير قوية.
- توفر الفئران المعدلة وراثياً والمؤفورة فلورياً رؤية محسنة للمكونات الخلوية.
- إن فهم بنية سطح العين أمر بالغ الأهمية لمختلف التطبيقات البحثية.
- يمكن لتقنيات التصوير الخالية من الوسوم أن تكمل الطرق الفلورية.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة للتصوير الحي لسطح العين لدى الفأر.
- استخدام مجهر متعدد الفوتونات مخصص لتحسين التصوير المرئي.
- إثبات قدرات الفئران المعدلة وراثياً ذات الفلورة المزدوجة في التصوير.
الطرق المستخدمة
- إعداد مجهر متعدد الفوتونات باستخدام عدسات شيئية وإعدادات ليزر محددة.
- استخدام مرايا ثنائية اللون وفلاتر تمرير النطاق لفصل الإشارات.
- التصوير الحي للفئران المخدرة على منصة مجهر مسخنة.
- التصور في الوقت الفعلي لبنى سطح العين.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لنوى الخلايا والأغشية والألياف العصبية.
- التصوير الخالي من الوسوم للبنى السدوية باستخدام توليد التوافقي الثاني.
- إثبات فعالية منصة الفوتونات المتعددة.
- التحقق من قدرات التصوير المرئي في الوقت الفعلي.
الاستنتاجات
- تُعد منصة المجهر متعدد الفوتونات فعالة في التصوير العيني.
- تعزز الفئران المعدلة وراثياً ذات الفلورة المزدوجة من رؤية البُنى العينية.
- يمكن لهذه الطريقة أن تطور الأبحاث في البيولوجيا العينية والمجالات ذات الصلة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح منصة المجهر متعدد الفوتونات هذه تصويراً حياً وخالياً من الوسوم لبنيات السطح العيني للفئران، مما يوفر رؤى بالغة الأهمية حول بيولوجيا القرنية والملتحمة من أجل اكتشاف الأدوية الرمدية. ومن خلال تصور الديناميكيات الخلوية، وبنية السدى، والشبكات الوعائية في الجسم الحي، تدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الآلية للأهداف العلاجية في النماذج قبل السريرية لأمراض العين. كما تعزز قدرة المنصة على التصوير عبر السطح العيني بالكامل مع تحديد دقيق للمواقع من الثقة التنبؤية في عمليات التحقق من الأهداف ومسارات تطوير المقايسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تصور نويات الخلايا، والأغشية، والألياف العصبية، والشعيرات الدموية في الأنسجة العينية الحية.
- القيمة التشغيلية: يدعم التحقق من صحة الأهداف الوظيفية من خلال الملاحظة في الوقت الفعلي لبنية السدى عبر توليد التوافق الثاني والديناميكيات الخلوية في المراسلين الفلوريسنت المزدوجين.
- القيمة التنبؤية: يعزز عملية فرز مجموعة المشاريع من خلال توفير قراءات كمية وقابلة للتكرار للتغيرات الهيكلية والخلوية في النماذج العينية ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية موثقة لسير العمل اللاحق من خلال تمكين التصوير عالي الدقة للمقصورات الظهارية، والسدوية، والبطانية، والوعائية.
- القيمة التشغيلية: معالجة توحيد المقايسات وقابلية تكرارها من خلال الاستحواذ الدقيق على مكدسات Z (Z-stack)، والفصل الطيفي لإشارات SHG والإشارات الفلورية، وتثبيت موضع مقلة العين.
- القيمة الاستراتيجية: تسليط الضوء على الجاهزية للفحص وإمكانية إعادة استخدام المنصة من خلال السماح بالتصوير عبر كامل سطح القرنية والملتحمة مع حد أدنى من السمية الضوئية.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- القيمة العلمية: يناقش صلة المرض من خلال تمكين إعادة بناء البنية الشعيرية ثلاثية الأبعاد في الملتحمة وتصور طبقات الظهارة الحوفية.
- القيمة التشغيلية: يصف الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال دعم التصوير الحي داخل الجسم مع تحديد دقيق للمواقع عبر مناطق سطح العين.
- القيمة التنبؤية: يتناول قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال توفير تصوير سدوي خالٍ من الوسوم ورسم خرائط خلوية تساهم في الفهم الآلي للمرضيات العينية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى التصوير قبل السريري، مما يدعم اختبار الفرضيات والحد من المخاطر الميكانيكية في أبحاث طب العيون.
- بيولوجيا الاكتشاف: يوضح كيف تدعم هذه الطريقة اختبار الفرضيات، وتوضيح المسارات، وتقليل المخاطر البيولوجية من خلال تمكين التصوير الحي للديناميكيات الخلوية والتركيبية في سطح العين.
- الفحص: يصف جاهزية المقايسة، وقابلية التكرار، والمخرجات الكمية من خلال التصوير التسلسلي Z-serial، وفصل الإشارات الطيفية، وظروف التصوير المستقرة.
- التحليلات: يسلط الضوء على القياسات، أو القراءات، أو المخرجات الإحصائية التي تساعد الفرق في مقارنة الظروف، بما في ذلك SHG لبنية الكولاجين و tdTomato/EGFP للتمركز الغشائي والنووي.
- الأبحاث الانتقالية: يربط هذه الطريقة بالاستمرارية قبل السريرية أو مواءمة المؤشرات الحيوية من خلال تمكين إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للشعيرات الدموية ورسم خرائط الطبقة الظهارية في النماذج ذات الصلة بالمرض.
- إعادة الاستخدام في المؤسسة: يصيغ هذه الطريقة كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام بدلاً من كونها تقنية ذات استخدام واحد، بحيث تكون قابلة للتكيف مع مختلف نماذج أمراض العيون ونقاط نهاية التصوير.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: الثقة التنبؤية، والتحقق من الهدف، وتقليل الغموض الميكانيكي في بيولوجيا سطح العين.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع من خلال حامل عين مخصص، وتثبيت مجسم (stereotaxic)، ومعايير تصوير مضبوطة.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن الاستمرار أو التوقف (go/no-go)، وكفاءة رأس المال، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال تمكين التصور المبكر لارتباط الهدف واستجابة الأنسجة.
- التأثير على المحفظة: تحديد الأولويات واتخاذ قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال قراءات كمية، وخالية من الوسوم، وفلورية عبر أقسام القرنية والملتحمة.
اعتبارات التنفيذ
- الخبرة العلمية المطلوبة في المجهر متعدد الفوتونات، وتشريح العين، والتعامل مع النماذج المعدلة وراثياً.
- احتياجات الأجهزة والبنية التحتية التحليلية، بما في ذلك ليزر التيتانيوم ياقوت، والمرايا ثنائية اللون، ومرشحات تمرير النطاق، والمنصة الآلية، وبرمجيات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.
- متطلبات التوحيد القياسي بين الفرق لبروتوكولات التصوير، وإعدادات الكشف عن الإشارات، ومسارات معالجة الصور (على سبيل المثال، ملحقات Fiji لتقليل الضوضاء وتحسين التباين).
- اعتبارات التكيف عبر أنظمة النماذج المختلفة، بما في ذلك تعديل تثبيت الجفن، وهلام ربط سطح العين، وأطوال موجات الإثارة لمختلف المراسلين الفلوريين.
- القيود العملية المدعومة بالمادة المصدر: يعد تثبيت مقلة العين بضغط معتدل دون التسبب في إصابة أمراً بالغ الأهمية، حيث أن الضغط غير الكافي أو المفرط يؤدي إلى تدهور جودة الصورة.
