A مجموعة القطيفة Femtoliter تخليق البروتين موازية على نطاق واسع من جزيئات الحمض النووي واحد
يونيو 20, 2020
الهدف العام للبروتوكول هو إعداد أكثر من مليون من قطرات femtoliter أمر، موحدة ومستقرة ومتناسقة بيولوجيا على الركيزة 1 سم2 2 من الألواح التي يمكن استخدامها تخليق البروتين خالية من الخلايا.
يتم إنتاج أكثر من مليون موحدة من قطرات على الركيزة بحجم الإصبع. ويتم توزيع جزيئات الحمض النووي واحد عشوائيا في كل قطرة. الغلة البروتين يتناسب مع عدد الجزيئات في قطرات.
يمكن استخدام أسلوبنا لقياس سريع وكمي لنشاط الإنزيم دون التعبير عن البروتين المعقد وتنقيته. للبدء، تعيين غطاء الزجاج على رف تلطيخ ووضع رف في ثمانية هيدروكسيد الصوديوم الضرس. Sonicate غطاء الزجاج ورف تلطيخ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
إزالة رف تلطيخ من هيدروكسيد الصوديوم وشطف الزجاج غطاء بالماء 10 مرات. جففي غطاء الزجاج بمدفع هوائي. ثم خبز وتجفيف الزجاج على غطاء لوحة ساخنة في 200 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
تحضير 0.05٪ حل أمينوسيلان. غمر الزجاج في هذا الحل واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. شطف غطاء الزجاج خمس مرات في الماء النقي.
ثم جفف غطاء الزجاج باستخدام بندقية الهواء. خبز على لوحة ساخنة في 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. وضع الركيزة الزجاجية غطاء على تشاك فراغ مخصصة لأغطية تدور.
الاستغناء 70 إلى 90 ميكرولترات من نوع-A CYTOP البوليمر في وسط الركيزة الزجاجية. ثم على الفور تدور معطف البوليمر. طلاء البوليمر الأولي تلف نوعية مجموعة microchamber النهائي.
الاستغناء البوليمر على مركز الزجاج الغطاء دون إدخال فقاعات الهواء. التقاط الزجاج المغلفة عن طريق عقد عليه في الزوايا ووضعها على رقائق الألومنيوم. خبز لمدة 30 دقيقة في 80 درجة مئوية ثم لمدة ساعة أخرى في 200 درجة مئوية.
الاستغناء 0.2 إلى 0.3 ملليلتر من ناظرة ضوئية في وسط الركيزة. على الفور تدور معطف مُنَسِر الصور في 6, 000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. استخدم مسحة منقوقة بالإيثانول لإزالة ضوئية الفوترس الزائدة من حواف الركيزة.
خبز الركيزة في 110 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لإعادة ترطيب جهاز التصوير، اسمحوا الركيزة الوقوف لمدة 30 دقيقة في الرطوبة النسبية من 42 إلى 60٪ تحميل الركيزة في قناع محاذير وفضحه لمدة 25 ثانية في وضع الاتصال فراغ. ثم غمر الركيزة في المطور لمدة خمس دقائق لحل المصور الضوئي المكشوفة.
شطف الركيزة 10 مرات باستخدام الماء النقي. ثم تجفيف الركيزة بدقة باستخدام بندقية الهواء. وضع الركيزة في غرفة رد الفعل من آلة النقش الايون التفاعلي وحفر CYTOP غطت فوتوارس مع البلازما الأكسجين.
بعد الحفر، وإزالة photoresist المتبقية عن طريق sonicating الركيزة في الأسيتون لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم سونيكات الركيزة في بروبانول لمدة خمس دقائق. شطف، sonicate، وشطف الركيزة مرة أخرى باستخدام المياه النقية كما هو موضح في المخطوطة.
ثم جفف الركيزة ببندقية هوائية. باستخدام قاطع سطح المكتب، وقطع مزدوج المغلفة لاصقة شريط فيلم Kapton في الأشكال microchannel محددة. عصا قطع من الشريط في الجزء السفلي من طبق بيتري شقة لتكون بمثابة سيد لصب PDMS.
صب خليط PDMS في طبق بيتري الشريط المنقوشة. ثم ضع طبق بيتري في غرفة فراغ صغيرة و deaerate خليط PDMS لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. ثم ضع طبق بيتري في فرن عند درجة 60 درجة مئوية واتركه بين عشية وضحاها لعلاج PDMS.
بعد الشفاء من PDMS ، قشر الداسترومير الشفاء من طبق بيتري واستخدام قاطع كابل مسطح لقطع كتل microchannel PDMS. ثم لكمة حفرة في كل نهاية من كل microchannel. وسيكون للركيزة التي تم إعدادها سابقاً مساحة لمجموعة الزهائق الدقيقة.
ضع قناة PDMS على هذا الجزء من الركيزة. ثم أدخل 200 ميكرولتر أنبوب تلميح في واحدة من الثقوب في microchannel PDMS. أولاً، إعداد حل رد فعل CFPS في أنبوب PCR.
ثم، وذلك باستخدام 200 تلميح الأنابيب غير مرشح ميكرولتر، رسم 10 ميكرولترات من الحل. أدخل طرف الأنابيب في فتحة مدخل القناة الدقيقة PDMS وادفع لأسفل على المكبس الأنابيب حتى يفيض الحل من منفذ microchannel. نقل جهاز FemDA إلى كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا.
تأكد من أن منطقة الصفيف microchamber تتحول بسرعة من شفافة إلى شفافة. رسم 300 ميكرولترات من النفط دافق ما قبل المبردة ونقل النفط على الفور إلى طرف الأنابيب من ثقب مدخل microchannel. يتحرك الزيت المتدفق إلى القناة الدقيقة وينضح حل التفاعل الزائد الموجود خارج الـ microchambers.
في وقت واحد إزالة اثنين من نصائح pipet إدراج من الجهاز. نقل الجهاز فورا من كتلة الألومنيوم إلى فيلم البارافين. أدخل طرف الأنابيب المعدة التي تحتوي على زيت الختم في مدخل القناة الدقيقة PDMS وحقن الزيت حتى يفيض من المأخذ.
يتم ختم قطرات femtoliter في الخرّجات الدقيقة الفردية من النفط. افتح صورة BF المُفرَد عنها. لإزالة الخلفيات المستمرة من كل إطار، حدد طرح الخلفية من القائمة Process .
أدخل 20 لنصف قطر الكرة المتداول. حدد مربع المعاينة وحدد "حسناً". حدد نعم عند سؤالك ما إذا كان يجب معالجة كافة الصور أم لا.
بعد ذلك، لتقليل الضوضاء، حدد العملية، الفلاتر، الوسيط. أدخل 2.0 القطاعات نصف القطر بالبكسل. حدد مربع المعاينة وحدد "حسناً".
حدد نعم عند سؤالك ما إذا كان يجب معالجة كافة الصور أم لا. بعد ذلك، حدد صورة، ضبط، عتبة لفصل الصور من microchambers من خلفية الصورة. من القائمة الإضافات، حدد FemDA، تحليل FemDA.
إدخال العدد الأدنى والقصوى التقريبي من وحدات البكسل للسة الصغيرة الواحدة. الحد الأدنى والحد الأقصى المتوقع من الدوران من microchambers وأرقام الإطارات بداية ونهاية، ثم حدد إنشاء العائد على الاستثمار للكشف عن microchambers. يتم عرض ROIs المكتشفة بنجاح في قائمة ROITable المنبثقة.
في إطار تحليل FemDA، حدد تطبيق قناع العائد على الاستثمار. فحص الصورة لمعرفة ما إذا كان تم الكشف عن الزرق الدقيقة بشكل صحيح. افتح صورة الفلوريسنس واحضرها إلى الأمام.
انقر فوق تطبيق قناع عائد الاستثمار مرة أخرى لإضافة ROIs إلى صورة الفلوريسنس. في إطار تحليل FemDA، حدد طلقة واحدة لتحليل بيانات نقطة النهاية للصورة. أدخل N لعدد وحدات البكسل العليا لاستخدام وحدات البكسل العلوية لكل عائد استثمار لحساب شدة المتوسط للقطيرة المقابلة.
ثم انقر على قياس كثافة لحساب الشدات الوسط لجميع قطرات الكشف. يتم تحديث جدول ROITable مع البيانات الجديدة من صورة الفلوريسنس ويتم عرض المدرج التكراري في إطار جديد. تصدير البيانات بالنقر فوق الزر حفظ كنص.
تم تغليف محلول الفلورسنت في رقة FemDA الدقيقة وتم قياس كثافة الفلورس ، التي ترتبط بحجم القطرات باستخدام المجهر. تم العثور على قطرات لديها توزيع حجم ضيق. كما أظهرت الصورة ثلاثية الأبعاد التي أعيد بناؤها من المجهر confocal حجم قطرات متسقة مع مرور الوقت.
وكانت القطرات مستقرة في درجة حرارة الغرفة دون فقدان التبخر أو التلوث المتبادل بين قطرات لمدة 24 ساعة على الأقل. تم تصنيع البروتين الفلورسنت mNeonGreen في FemDA. وتم تحليل بيانات صورة المكدس بمساعدة صورة الحقل الساطعة المتزامنة.
لأن كثافة الفلوريسنس لكل قطرة تقاس من غلة البروتين، الرسم البياني يوحي بقوة أعداد غير متساوية من جزيئات الحمض النووي لكل قطرة. كان احتمال قطرات تحتوي على أعداد مختلفة من جزيئات الحمض النووي مناسبا تماما لتوزيع بواسون. كما تم تركيب إنزيم فوسفاتاتيز القلوي في FemDA مع الصور التي يتم التقاطها كل خمس دقائق.
وأظهر رد الفعل توزيعاً سرياً مماثلاً لشدة الفلوريسنس في القطرات في وقت سابق من النقاط، وتحققت نتائج الرسم البياني من أن الأعداد غير المتساوية لجزيئات الحمض النووي في القطرات. يمكن استرداد جزيء الحمض النووي المفرد المغلف في قطرات فردية، وتضخيمه، وتسلسله يجعله أعلى نسبة من البروتينات يمكن فحصها. تقنية قطرات يضم إما حجم صغير وإما عالية الاستقرار يسمح للتشخيص الجزيئية سريعة ودقيقة من أمراض السرطان مع المؤشرات الحيوية محددة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This protocol describes the preparation of over one million uniform and stable femtoliter droplets on a planar substrate for cell-free protein synthesis. The droplets facilitate rapid and quantitative enzyme activity measurement.
Key Study Components
Area of Science
- Biotechnology
- Protein Synthesis
- Enzyme Activity Measurement
Background
- Cell-free protein synthesis is a valuable tool in biotechnology.
- Uniform droplets can enhance reaction conditions and product yield.
- Traditional methods of protein expression and purification can be complex.
- This technique simplifies the process by using droplets for direct measurement.
Purpose of Study
- To develop a method for producing uniform femtoliter droplets.
- To enable cell-free protein synthesis in a simplified manner.
- To allow for rapid and quantitative enzyme activity measurements.
Methods Used
- Preparation of a planar substrate for droplet formation.
- Distribution of single DNA molecules into the droplets.
- Measurement of protein yield based on DNA molecule concentration.
- Sonication of cover glass to ensure uniform droplet formation.
Main Results
- Over one million uniform droplets were successfully produced.
- Protein yield was found to be proportional to the number of DNA molecules in each droplet.
- The technique allows for efficient enzyme activity measurement.
- Elimination of complicated protein expression and purification steps.
Conclusions
- The developed protocol provides a reliable method for droplet-based protein synthesis.
- This approach can significantly streamline enzyme activity assays.
- Future applications may expand to various biotechnological fields.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Cleaning and Silanizing the Glass
1:26
Spin-Coating the Glass Substrate
2:40
Photolithography, Etching, and Cleaning
3:47
Fabricating the Microchamber Array Device
5:04
Generating the Femtoliter Droplet Array (FemDA)
6:35
Image Data Analysis
8:45
Results: Cell-Free Protein Synthesis in FemDA
10:07
Conclusion
![عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56110.jpg%3Fv%3D2026-08-27T13%253A36%253A59.000Z&w=384&q=75)
