فصل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجياً، الببتيدات من المصادر الطبيعية والبروتينات من الميكروبات بواسطة طريقة التركيز الأيزوئي الإعدادي (IEF)

يصف بروتوكولنا النتائج الجديدة حول فصل وتنقية الجزيئات النشطة من مستخلص نباتي. يمكن للعلماء استخدام هذه الطرق لعزل الجزيئات الصغيرة والببتيدات من مصادر المنتجات الطبيعية للمستخدمين العلاجيين. تعرف على مكونات الجهاز وطرق تجميعها.

ومن المهم التأكد من أن العينة التي سيتم فصلها يتم إعدادها من خلال المبادئ التوجيهية المقترحة. يتضمن هذا الأسلوب عمليات تجميع متعددة من الصك. وسوف تساعد العرض التوضيحي المرئي المستخدمين على متابعة وتطبيقها بنجاح على البحث.

بعد تجميع المرحلة السائلة، وحدة IEF كما هو موضح في دليل التعليمات، توازن أغشية تبادل أنيون مع 0.1 هيدروكسيد الصوديوم الضرس وأغشية تبادل الأحماض مع 0.1 حمض الفوسفوريك المولر. محاذاة حشيات المطاط بحيث تظل الثقوب الثلاثة مستطيلة كبيرة غير مفككة بالمطاط. وهذا سيساعد على تبادل الأيونات بين القطب وحجرات العينة عبر الغشاء أثناء الكهرباء.

تجميع الجزء الداخلي والخارجي من القطب الكهربائي عن طريق محاذاة الثقوب مستطيلة الثلاثة في الحشيات تبادل أيون. ثم تعبئة الأقطاب الكهربائية مع الشوارد الخاصة بهم لمنع الأغشية الخاصة بهم من الجفاف. المقبل، وتشديد حامل المسمار البلاستيك لضمان التجمع خالية من تسرب.

تغطية لوحات مجموعة العينة مع شريط الختم. المقبل تجميع أجزاء من غرفة التركيز على إصبع التبريد السيراميك في التسلسل التالي: قطب الأنود، النايلون غشاء الأساسية، غرفة التركيز وكاثود القطب. باستخدام حقنة 50 ملليلتر، املأ غرفة التركيز بالماء المقطر المُبرّر قبل التبريد.

بالنسبة لخلية IEF القياسية، أضف 60 ملليلتر من الماء. قم بتوصيل وحدة IEF بماء التبريد في أربع درجات مئوية. تشغيل وحدة في 15 واط و 3000 فولت حتى يستقر الجهد، ما يقرب من ثلاث إلى خمس دقائق.

ثم، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة. باستخدام جامع الكسور، وإزالة الماء من الخلية. إعادة ختم لوحات التجميع مع ختم الشريط.

إضافة 0.6 غرام من استخراج مصنع Sylvestre Gymnema، إلى 60 ملليلتر من الماء المقطر. حل استخراج النبات عن طريق خلط في أنبوب الأسطوانة لمدة خمس دقائق. لإزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان، الطرد المركزي هذا الحل في 10،000 مرة G لمدة خمس دقائق.

نقل supernatant إلى كوب زجاجي 150 ملليلتر وإضافة أمفوليت لإنشاء حل 1٪من حيث الحجم، ما يقرب من 0.6 ملليلتر. باستخدام حقنة 50 ملليلتر مع 1.5 بوصة 19 قياس إبرة نهاية حادة، تحميل هذا الحل في خلية IEF من خلال لوحات جمع عينة. ثم قم بإزالة الخلية من الحامل واضغط على غرفة القطب الكهربائي ، لطرد وإزالة أي فقاعات.

قم بتوصيل الوحدة بماء التبريد. مع امدادات الطاقة إلى ثابت 15 واط تبدأ تجزئة. تشغيل وحدة IEF حتى يصل الجهد إلى قيمة ثابتة، ما يقرب من ثلاث ساعات.

بعد الضغط على الحصاد على زر محاذاة دبابيس جامع الكسر مع لوحات جمع. دفع دبابيس من خلال الشريط ختم لبدء جمع كسور Sylvestre Gymnema. تنمو مستعمرة واحدة من C.albicans والخميرة بيبيتون مرق dextrose بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز.

نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي وجمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة خمس دقائق. بعد إزالة supernatant، تعليق خلايا الخميرة في المخزن المؤقت وتدوير التعليق في أنبوب الأسطوانة لمدة ساعة واحدة في خمس درجات مئوية. لإزالة خلايا الخميرة، الطرد المركزي تعليق في 10، 000 مرات G لمدة خمس دقائق.

ثم تصفية استخراج البروتين من خلال مرشح ميكرومتر 0.45. نقل استخراج البروتين إلى أنابيب غسيل الكلى وsingyze ضد الماء لمدة 15 ساعة في أربع درجات مئوية. بعد تقدير تركيز البروتين، جمع كمية من مستخلص البروتين تحتوي على 500 ملليغرام من البروتين الكلي.

تخفيف 500 ملليغرام من البروتين في 60 ملليلتر من الماء التي تحتوي على 1٪ أمبيروليت من حيث الحجم. باستخدام حقنة، قم بتحميل مستخلص البروتين المخفف في خلية IEF وتشغيل الوحدة بسرعة ثابتة تبلغ 15 واط لمدة أربع ساعات. منذ هذا الصك يستخدم امدادات الكهرباء عالية الجهد، يجب على المستخدم اتخاذ جميع الاحتياطات لتجنب أي اتصال مباشر مع الأقطاب الحية.

يحتوي جامع الكسر على 20 أنبوبًا بلاستيكيًا، كل منها 12 ملليمترًا في 75 ملليمترًا. وهو متصل بمضخة الفراغ الاستعداد لجمع الكسور عن طريق الضغط على زر الحصاد.

ثم محاذاة دبابيس جمع 20 على جامع الكسور مع لوحة جمع 20 حتى مختومة خلية التركيز. دفع دبابيس جمع من خلال الشريط الختم وفي وقت واحد تشغيل مضخة فراغ. كل أنبوب سوف جمع جزء من البروتين حوالي ثلاثة ملليلتر.

بعد تقليل وغلي كسور البروتين، وتحليلها على 12.5٪ هلام SDS الصفحة. وصمة عار هلام مع صبغة الأزرق Coomassie ووضعها على الروك في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات destain هلام.

ثم قم بتسجيل صورة الجل باستخدام صورة هلام. إعداد تعليق خلية الخميرة عن طريق تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها من C.albicans في نسبة 1:1000 في ثقافة الخلايا في RPMI المتوسطة تكملها مع الجلوكوز 50 ملليمتر. إضافة 90 ميكروليتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا.

بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من كل كسر G.sylvestre لفصل الآبار. كتحكم سلبي، إضافة 10 ميكرولترات من الماء مع 1٪ أمبيروليت في آبار منفصلة. بعد احتضان لوحة 96 بئر في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، ومراقبة لوحة تحت المجهر.

عدم وجود نمو خيوط يشير إلى تثبيط C.albicans الخميرة إلى hypha التحويل. تم الحصول على 20 جزء من استخراج G.sylvestre بواسطة المرحلة السائلة IEF. جزيئات داكنة اللون، والأحماض الرياضية، هاجرت إلى وإثراء في نهاية أنود من الوحدة.

لوحظت الكسور الصفراء الشفافة في نهاية الكاثود. تم تخفيض Aliquots من كل انكسار G.sylvestre ، والمغلي وحلها من قبل صفحة SDS. وأظهرت بقعة Coomassie الأزرق عصابة مختلفة من البوليبتيد في حوالي خمسة كيلودالتون، المخصب في الكسور 16 من خلال 19.

الأحماض Gymnemic في جزء واحد، والكسور القليلة القادمة لم يتم الكشف عنها لأنها ليست بروتينية. ومع ذلك، يمكن فصل هذه الجزيئات بواسطة TLC والكشف عنها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لم يحتوي الكسر 10 على كمية يمكن اكتشافها من هذه الجزيئات الصغيرة مما يشير إلى أن معظم الجزيئات الصغيرة العضوية تم إثراؤها في كسور من واحد إلى ثلاثة.

تم فحص جميع كسور G.sylvestre 20 لتثبيط تحويل الخميرة إلى الواصلة والنمو الواصل في C.albicans. ولوحظ أكبر تثبيط في الكسر الأول ولوحظ وجود تثبيط ضئيل أو غير مثبّت في الكسور 10 وما فوق. تم تجزئة بروتينات سطح الخلايا من C.albicans باستخدام المرحلة السائلة IEF.

و(aliquots) من 18 كسراً تم تحليلها بواسطة صفحة SDS كانت البروتينات المخصبة مرئية في عدة أجزاء. البداية، لا يمكن فصل جزيئات صغيرة من قبل تركيز isoelectric لأنه يعتقد أنها غير المتنقلة.

تظهر دراساتنا أنها مُمَرَة، على الأقل أسبوعية، ويمكن استكشاف هذه الطريقة بشكل أكبر للجزيئات الصغيرة الأخرى.