رسم خرائط عالية الدقة للتفاعلات البروتينية-الحمض النووي في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس باستخدام Chromatin immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

تتمثل الميزة الرئيسية لطريقة ChIP-exo الخاصة بنا في تحسين دقة رسم الخرائط لتفاعلات الحمض النووي للبروتين في الخلية مقارنة بطريقة الترسيب المناعي التقليدية للكروماتين. لتحضير حبات البروتين G المغناطيسية ل ChIP ، اخلطي الخرزات المغناطيسية حتى تتجانس. ثم أضف 25 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية إلى أنبوب منخفض الارتباط بالبروتين ملليلتر.

أضف ملليلتر واحد من محلول الحظر إلى الخرز. تخلط جيدا عن طريق سحب العينة ، ثم ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. بمجرد أن يصبح المادة الطافية صافية ، قم بإزالتها.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول الحظر إلى الخرز. ضع الأنبوب على منصة هزازة عند أربع درجات مئوية وصخور لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية.

أضف 500 ميكرولتر من محلول المنع إلى الخرز المغناطيسي. قم بتدوير الجسم المضاد لفترة وجيزة ضد Islet-1 ، ثم أضف أربعة ميكروغرامات من الجسم المضاد إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المغناطيسي. ضع الأنبوب الذي يحتوي على حبات مغناطيسية وجسم مضاد Islet-1 على منصة هزاز عند أربع درجات مئوية وصخور لمدة ست إلى 24 ساعة.

لبدء ترسيب الكروماتين المناعي ، اغسل الخرز المطلي بالأجسام المضادة في مليلتر واحد من محلول الحظر. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المطلي بالأجسام المضادة على منصة هزازة عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الدوران لفترة وجيزة ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخرز المطلي بالأجسام المضادة في 50 ميكرولتر من محلول الحظر. أضف ملليلترا واحدا من المحللات الصوتية إلى الخرز المطلي بالأجسام المضادة ، ثم احتضن العينة على منصة هزازة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد السماح للعينة بالحضانة طوال الليل ، اجمع السائل من الغطاء عن طريق تدوير الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم ضع الأنبوب على رف مغناطيسي.

وبعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة. بعد ذلك ، قم بإجراء سلسلة من الغسيل على النحو التالي. أضف ملليلترا واحدا من مخزن الغسيل البارد الذي يحتوي على CPI إلى العينة.

امزج العينة على منصة هزاز على أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتدوير أنبوب العينة لفترة وجيزة ، ثم ضعه على رف مغناطيسي. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.

بالنسبة للتفاعل الأنزيمي الأول والإصلاح ومخلفات DA ، أضف 38 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى العينة ، ثم أضف مزيج تفاعل الإعداد النهائي ومزيج إنزيم الإعداد النهائي. امزج محتويات الأنبوب عن طريق سحب العينة ، ثم احتضن العينة عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل حبات العينة بمحلول غسيل عالي الملح ، ومخزن غسيل كلوريد الليثيوم ، ومخزن مؤقت لكلوريد الهيدروجين تريس 10 ملليمولار كما هو موضح سابقا.

لإجراء ربط محول المؤشر ، أضف 27 ميكرولترا من المخزن المؤقت البارد 10 ملليمولار لكلوريد الهيدروجين Tris إلى العينة. ثم أضف محول الفهرس ومحسن الربط ومزيج ligase الرئيسي. احتضان العينة عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

مرة أخرى ، اغسل حبات العينة بمحلول غسيل عالي الملح ، ومخزن غسيل كلوريد الليثيوم ، ومخزن مؤقت لكلوريد الهيدروجين تريس 10 ملليمولار. ثم أضف 47 ميكرولتر من محلول كلوريد الهيدروجين البارد 10 ملليمولار إلى العينة. لإصلاح الشق في الحمض النووي الناتج عن رابطة الفوسفوديستر المفقودة ، أضف 11.1 ميكرولترا من مزيج التعبئة إلى العينة.

احتضان العينة عند 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد سلسلة من الغسلات ، أضف 50 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج البارد المعقم إلى العينة. لاستيعاب الحمض النووي ChIP في الاتجاه الأولي: خمسة أولي إلى ثلاثة ، أضف المخزن المؤقت لامدا exonuclease و lambda exonuclease واخلط العينة عن طريق سحب العينات.

احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد اكتمال الهضم ، كرر الغسلات الثلاثة للمرة الأخيرة. لتصفية عينة ChIP من الخرزات ، أعد تعليق العينة في 75 ميكرولتر من مخزن شطف ChIP والحاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 130 مرة G.أضف 2.5 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز K إلى العينة.

قم بدوامة العينة لفترة وجيزة ، ثم احتضانها طوال الليل عند 65 درجة مئوية. قم بتدوير العينة لفترة وجيزة وضعها على رف مغناطيسي. بعد دقيقة واحدة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

تنقية وإزالة الحمض النووي. بعد تنقية الحمض النووي الملوط، انقل 16 ميكرولترا من عينة الحمض النووي المستخرجة إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أضف 1.2 ميكرولتر من مزيج تغيير الطبيعة والتلدين التمهيدي إلى العينة.

باستخدام البرنامج الموضح في الجدول السادس من المخطوطة ، قم بتغيير طبيعة الطبيعة والبادئات الصلبة للقالب DNA. أضف ثلاثة ميكرولترات من مزيج تمديد التمهيدي إلى العينة وقم بتشغيل برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح في الجدول السابع من المخطوطة. أضف 4.1 ميكرولتر من مزيج مخلفات DA إلى العينة وقم بتشغيل العينة باستخدام برنامج PCR في الجدول الثامن من المخطوطة.

ثم أضف 21.5 ميكرولتر من مزيج ربط المحول العالمي إلى العينة واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية. أضف 29 ميكرولترا من مزيج LM-PCR إلى العينة ، ثم قم بتشغيل العينة باستخدام البرنامج من الجدول 10 من المخطوطة. بعد 18 دورة من LM-PCR ، تم تحليل عينات ChIP-exo من الخلايا العصبية الحركية للفأر على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪.

أظهرت نتائج ChIP-exo Islet-1 مكتبات الحمض النووي المضخمة حوالي 200 إلى 400 زوج أساسي مما يشير إلى أن مكتبات ChIP-exo قد تم تضخيمها بنجاح بواسطة LM-PCR. يمثل النطاق المكون من حوالي 100 زوج أساسي القطع الأثرية من المحولات وبادئات PCR. يوضح التحكم في عدم وجود أجسام مضادة أن الحمض النووي غير المحدد للخلفية قد تم هضمه عن طريق علاج نوكلياز خارجي لامدا.

باستخدام ChIP-exo و ChIP-seq ، تم تحديد المواقع المرتبطة ب Islet-1. كانت إشارة ChIP-exo مركزة بشكل كبير في مواقع ربط Islet-1 التي اكتشفت أنماط ربط عامل نسخ Islet-1 العنقودية. عرضت إشارة ChIP-seq إشارات أوسع تشير إلى أن ChIP-exo كان لديه دقة رسم خرائط أعلى من ChIP-seq ل Islet-1.

غالبا ما تربط عوامل النسخ المتعددة الحمض النووي بجانب بعضها البعض كمركب بروتين وحمض نووي. يسمح لنا ChIP-exo بدراسة كيفية التعرف على عوامل النسخ المتعددة للحمض النووي المستهدف وتنظيمه.