عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

تتمثل ميزة استخدام الطرد المركزي التفاضلي لهذا البروتوكول في أنه يمكن تطويره بسهولة حتى لترات ، وبالتالي فهو مثالي لعزل الإكسوسومات عن الخلايا الليفية الأولية. يمكن الحصول على الإكسوسومات المنقاة من أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة المعزولة عن نماذج الأمراض المختلفة. يمكن استخدام الإكسوسومات كمؤشرات حيوية تشخيصية.

إثبات هذا الإجراء سيكون دياثا فان دي فليكيرت ، عالمة من مختبر d'Azzo للبدء ، قم بوزن عضلات الفأر ثم نقلها إلى طبق طوله 10 سم. العمل تحت غطاء السلامة الحيوية ، افرم العضلات بمشارط لإنتاج عجينة ناعمة. انقل معجون العضلات المفروم ناعما إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، وأضف محلول الهضم باستخدام 3.5 أضعاف الحجم لكل ملليغرام من الأنسجة.

احتضن لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. للمساعدة في التفكك الكامل، امزج التعليق جيدا باستخدام ماصة سعة 5 ملليلتر كل 10 دقائق. لتعطيل محلول الهضم ، أضف 20 مل من DMEM Complete إلى معلق الخلية.

ماصة من خلال مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب سعة 50 ملليلتر ، ثم اغسل مصفاة الخلية ب 5 ملليلتر إضافية من DMEM Complete. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM Complete.

قم بزرع الخلايا في طبق طوله 10 سم ، ثم ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، و 3٪ أكسجين. يجب الحفاظ على مزارع الخلايا الليفية للعضلات الهيكلية عند مستوى منخفض من الأكسجين لضمان ظروف الإضاءة الفسيولوجية. يبلغ مستوى الأكسجين في العضلات الهيكلية حوالي 2.5٪ بعد أن تصل الخلايا إلى 100٪ من التقاء ، قم بزراعتها ليوم إضافي ، ثم اشطفها باستخدام PBS وأضف ملليلترا واحدا من محلول التربسين.

بعد احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق ، أوقف التربسين بإضافة 10 ملليلتر من DMEM Complete. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من DMEM كاملة وبذر الخلايا في طبق 15 سم.

اجمع الوسط المكيف من الخلايا الليفية المزروعة في أنبوب سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي الوسط المكيف عند 300 جرام لمدة 10 دقائق لتكسير الخلايا الحية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر وحبيبات الخلايا الميتة عن طريق الطرد المركزي للأنبوب عند 2 ، 000 جم لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 38.5 مليلتر وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 10 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة لإزالة العضيات والأجسام موت الخلايا المبرمج وشظايا الغشاء. لحبيبات الإكسوسومات ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب فائق الوضوح سعة 38.5 مليلتر ، وقم بتشغيله بجهاز طرد مركزي فائق عند 100 ، 000 جرام لمدة 1.5 ساعة. تخلص من المادة الطافية بعناية ، مع ترك ما يقرب من ملليلتر واحد من الوسط المكيف.

اغسل حبيبات الإكسوسوم وأعد تعليقها في ما يصل إلى 30 مل من PBS المثلج. الطرد المركزي للإكسوسومات مرة أخرى عند 100 ، 000 جرام لمدة 1.5 ساعة. لإكمال التنقية ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الماصة ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات الخارجية

يمكن أن تكون خطوة حبيبات الإكسوسوم فضفاضة ويمكن فصلها بسهولة. لذلك ، يجب أن تتم إزالة المادة الطافية PBS بعناية فائقة بمساعدة ماصة سعة 200 ميكرولتر. أعد تعليق الحبيبات في PBS المثلج باستخدام 25 ميكرولتر لكل طبق 15 سم من الخلايا الليفية.

أخيرا ، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين BCA وقارئ الصفيحة الدقيقة عند 562 نانومتر. هذا البروتوكول هو طريقة قابلة للتكرار ومتسقة للغاية لتنقية الإكسوسومات. يظهر المجهر الإلكتروني للإرسال الأحجام الموحدة نسبيا لهذه الإكسوسومات.

تظهر اللطخة المناعية لمحاللات الإكسوسوم نمطا قانونيا للتعبير عن البروتين وغياب ملوثات البروتين LDH والكالنيكسين. تم فصل الإكسوسومات بواسطة تدرج كثافة السكروز ، وتم فحص الكسور الفردية على لطخة غربية بأجسام مضادة ضد Alix و CD9 و CD81. ترسيب الإكسوسومات باستمرار في الكسور من ثلاثة إلى ستة.

يمكن استخدام الإكسوسومات المعزولة والمركزة النشطة بيولوجيا في الفحص المجهري الإلكتروني وتحليلات قياس الطيف الكتلي ، وكذلك لتجارب الامتصاص في المختبر وفي الجسم الحي للدراسات الوظيفية. هذا البروتوكول مناسب لعزل الإكسوسومات عن الخلايا منخفضة الإفراز ويمكن تطبيقه لاستكشاف تورط الإكسوسومات في الأمراض الليفية البشرية.