إدخال طفرات نقطية في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام تحرير الجينوم السلس
May 10th, 2020
هنا ، نصف طريقة مفصلة لتحرير الجينات السلس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام بلازميد متبرع قائم على الخنزير وطفرة Cas9 nickase. تم إدخال طفرات نقطتين في إكسون 8 من موضع العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs).
تحرير الجينات في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أمرا صعبا. يوفر هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لتحرير الجينوم في هذه الخلايا باستخدام حالة Cas-90 المقترنة جنبا إلى جنب مع ناقل الاستهداف. إنه موثوق وسهل المتابعة.
الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه تحرير جيني سلس. يساعد الاختيار المكون من خطوتين على زيادة الخلايا المستهدفة وجعل فحص التنميط الجيني أكثر كفاءة. الحفاظ على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات على اللامينين المؤتلف 21 الأسطح المشفرة في وسط mTeSR1.
يجب أن تصل الخلايا إلى 70 إلى 85٪ من التقاء ، بعد 72 ساعة من نسبة الانقسام من واحد إلى ثلاثة. في يوم التعدي ، قم بتغطية ما يكفي من الآبار من صفيحة 24 بئرا مع 300 ميكرولتر من محلول اللامينين 521 ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء برفق وأضف على الفور 300 ميكرولتر من وسط mTeSR1 الطازج ، مع استكمال 10 مثبطات ميكرومولار ROCK لكل بئر.
ثم ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. خذ مخزون الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات من الحاضنة. قم بإزالة الوسط المستهلك وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مليلتر واحد من DPBS المعقم.
ثم أضف ملليلترا واحدا من كاشف تفكك الخلايا اللطيف إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني دقائق لفصل الخلايا. اضغط برفق على اللوحة للتأكد من أن الخلايا يمكن أن تنفصل بسهولة. ثم استخدم طرف P1000 لرفع الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
أضف ملليلترين من وسط mTeSR1 مع مثبط ROCK لإنهاء التفكك. امزج التعليق جيدا وانقله إلى أنبوب سعة 50 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 200 جم لمدة ثلاث دقائق.
ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في ملليلترين من وسط mTeSR1 باستخدام مثبط ROCK. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق. انقل 800 ، 000 إلى 1 مليون خلية إلى أنبوب 1.5 مليلتر لكل تفاعل نووي وقم بطردها عند 200 جم لمدة ثلاث دقائق.
ثم استنشق بعناية المادة الطافية. امزج ثلاثة ميكروغرامات من بلازميدات التعبير عن الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه Cas-9n المزدوجة وخمسة ميكروغرامات من بلازميد ناقل الاستهداف في 100 ميكرولتر من محلول النواة المختلط من مجموعة نوة الخلايا الجذعية البشرية. قم بإعداد مزيج بلازميد التحكم في GFP أيضا.
أعد تعليق الخلايا بمزيج الحمض النووي وانقلها إلى كوفيت التثقيب الكهربائي ، مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء. قم بالكهرباء للخلايا باستخدام جهاز النواة باستخدام الحالة المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. أضف على الفور 500 ميكرولتر من وسيط mTeSR1 الطازج والدافئ المكمل ب 10 مثبطات ميكرومولار ROCK إلى الخلايا الكهربائية.
ثم انقل المزيج إلى بئرين من اللوحة المعدة مسبقا 24 بئر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مزودة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا بالتعافي. استبدل وسط صيانة الخلية بعد 12 إلى 16 ساعة ، واسحب مثبط ROCK إذا أنشأت الخلايا اتصالا بين الخلية والخلية.
بعد 24 إلى 48 ساعة ، تحقق من كفاءة النواة عن طريق فحص تعبير GFP في خلايا التحكم. ابدأ في اختيار الخلايا عن طريق استكمال وسط mTeSR1 بميكروغرام واحد لكل مليلتر من البيرومايسين ، بعد 48 ساعة من النواة. بعد 72 ساعة ، استكمل الوسط ب 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر من البيرومايسين.
إذا كان التقاء الخلية أقل من 30٪ ، فاستكمل أيضا الوسط بمثبطات ROCK 10 ميكرومولار. بعد أربعة إلى ستة أيام من مرور النواة ، تمر الخلايا المقاومة للبورومايسين إلى 10 إلى 15 96 لوحة بئر بتركيز 0.8 خلية لكل بئر. تأكد من استكمال الوسيط بمثبط ROCK والبورومايسين.
حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 12 يوما لتشكيل مستعمرات مشتقة من خلية واحدة. تعبئة الوسط بعد سبعة أيام من البذر. ضع علامة على الآبار التي تحتوي على مستعمرة واحدة واستبدل الوسط بوسط mTeSR1 طازج ، يحتوي على 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر من البيورومايسين ، ولكن لا يوجد مثبط ROCK.
قم بزراعة الخلايا لمدة يومين آخرين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم قم بتغيير الوسط للآبار التي تحتوي على مستعمرات غير متمايزة. اكشط المستعمرات برفق وانقل تعليق الخلية من مستعمرة واحدة إلى بئرين جديدين على 96 لوحة بئر منفصلة.
واحد للتنميط الجيني والآخر للصيانة. بمجرد أن يصل التقاء خلايا التنميط الجيني إلى 50٪ أو أعلى ، تخلص من الوسط المستهلك واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS. قم بتحليل الخلايا باستخدام Bradley Lysis Buffer وعزل الحمض النووي الجيني من كل بئر.
بعد إجراء ثلاثة تقاطع أولي PCR وتسلسل المنتجات ، احتفظ بالمستعمرات بالنمط الجيني الصحيح وتخلص من الباقي. قم بتوسيع المستعمرات الصحيحة تحت اختيار البيرومايسين المستمر ، وقم بتجميدها في أقرب وقت ممكن. تم استخدام هذا البروتوكول لإدخال طفرتين نقطتين في Exon8 من جين ألفا النووي لخلايا الكبد.
تم استخدام طريقة PCR ثلاثية التمهيدي للكشف عن الخلايا المستهدفة بشكل صحيح ، وتم إجراء تسلسل Sanger لتأكيد نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد إزالة شريط الاختيار ، تم تسلسل المنطقة المعدلة مرة أخرى لتأكيد الإدخال الصحيح لطفرات النقطية المرغوبة. تم اختيار المستعمرات ذات النمط الجيني الصحيح وتم توصيف الخلايا قبل إجراء مزيد من التحليل.
تمتلكالخلايا المعدلة نفس مورفولوجيا الخلايا الأبوية وتعبر عن علامات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بما في ذلك عوامل النسخ Nanog و Oct4 ، بالإضافة إلى علامات سطح الخلية ، SSEA-4 و TRA-160. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من التقاء الخلية بعد اختيار بورومايسين خلال ال 24 ساعة الأولى. من الضروري استكمال الوسيط بمثبط ROCK.
إذا كان التقاء الخلية أقل من 30٪ للحفاظ على استمرار الخلايا. بمجرد إنشاء خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المعدلة بالجينوم ، يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجينات أو التمايز الموجه. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة أسئلة مختلفة ، مثل الوظيفة المحددة للجينات أو التصحيح الجيني المستهدف للأمراض الوراثية.
نظرة عامة
تتناول هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا لتحرير الجينات بشكل سلس في الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام بلازميد متبرع قائم على piggyBac ومتحولة Cas9 nickase. تتمكن الطريقة بنجاح من إدخال تحورين في الموقع HNF4α في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تحرير الجينات
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- علم الجينوم
الخلفية
- تحرير الجينات في الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية أمر معقد.
- يوفر Cas9 nickase المقترن طريقة موثوقة للتحرير.
- يعد تحرير الجينوم السلس مفيدًا للتعديلات الدقيقة.
- الفحص الجيني الفعال مهم للتعديل الناجح.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة للتحرير الدقيق للجينات في الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية.
- لإدخال تحورات محددة في جين HNF4α.
- لتعزيز كفاءة اختيار الخلايا المعدلة.
الطرق المستخدمة
- الحفاظ على الخلايا الجذعية على أسطح اللامينين المؤتلفة.
- نوكليوفنشن الخلايا مع Cas9 ونواقل الهدف البلازميدية.
- استخدام اختيار البوروميسين لعزل الخلايا المعدلة بنجاح.
- الفحص الجيني والتسلسل لتأكيد التحرير الناجح.
النتائج الرئيسية
- تم إدخال تحورين بنجاح في الموقع HNF4α.
- حافظت الخلايا على خصائصها متعددة القدرات بعد التحرير.
- تم تأسيس طرق اختيار وفحص جيني فعالة.
- عبّرت الخلايا المعدلة عن علامات متعددة القدرات الرئيسية.
الاستنتاجات
- يمكن البروتوكول من تحرير دقيق للجينات في الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية.
- يوفر أساسًا لدراسة وظيفة الجين والتمايز.
- تشمل التطبيقات المستقبلية التحقيق في أدوار الجينات المحددة في التطور.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Seamless genome editing in human pluripotent stem cells enables precise interrogation of gene function and disease modeling at the earliest stages of drug discovery. The protocol's efficiency and reliability in introducing point mutations at the HNF4α locus support high-confidence target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical research, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise introduction of disease-relevant mutations for functional genomics studies.
- Supports robust target validation by generating isogenic cell lines with defined genetic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function in human cellular contexts.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined cell systems for assay development and compound screening.
- Ensures reproducibility and standardization through seamless editing and rigorous genotyping.
- Enables quantitative readouts by confirming precise genomic modifications via PCR and sequencing.
- Supports scalable generation of cell lines for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cell models with disease-relevant genotypes for translational biomarker studies.
- Maintains pluripotency and differentiation potential, supporting continuity into preclinical validation.
- Reduces biological risk by confirming genetic and phenotypic fidelity of edited lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated genetic models.
Pipeline & Workflow Integration
This genome editing protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless transition from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene modification.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell lines for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Provides robust genotyping and sequencing outputs for confident comparison of edited versus parental lines.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by generating models with disease-relevant mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating custom-edited pluripotent stem cell lines across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection, and molecular genotyping.
- Needs access to electroporation devices, high-quality plasmids, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell handling and selection protocols.
- Adaptation may be needed for different gene targets or cell line backgrounds.
- Cell viability and confluency must be closely monitored during selection and expansion phases.
