العزلة المتزامنة وثقافة Myocytes الأذينية، myocytes البطينية، وغير Myocytes من قلب فأرة البالغين

مرحبا ، أنا كريس جلمبوتسكي. أنا أستاذ الطب في كلية الطب بجامعة أريزونا في فينيكس. وأنا مدير مركز القلب والأوعية الدموية الانتقالي الموجود أيضا هنا في فينيكس.

أن أقدم لكم اليوم شخصين سيعرضان تقنيتنا الجديدة ، الدكتور إريك بلاكوود ، زميل ما بعد الدكتوراه الأول وأعضاء هيئة التدريس في التدريب ، وكبيرة الباحثين الموسيتين ألينا بلال. تحد بروتوكولات عزل الخلايا العضلية القلبية الحالية من كمية الخلايا وقابليتها للحياة في المزرعة ، مما يخلق مأزقا تجريبيا لتعزيز فهمنا لفسيولوجيا القلب والفيزيولوجيا المرضية. لا يهدف هذا البروتوكول إلى تسريع عملية عزل خلايا قلب الفئران البالغة فحسب ، بل يهدف أيضا إلى زيادة إنتاجية الخلايا وقابلية الخلايا الأذينية والبطينية للحياة في وقت واحد من قلب فأر واحد.

هذه التقنية لها آثار عميقة على الاكتشاف العلاجي وأن أمراض مثل الرجفان الأذيني يمكن تمييزها بشكل أفضل على مستوى محدد من نوع الخلية ، مما يسمح بتحديد الأهداف العلاجية. نوصي الأفراد الذين ليس لديهم خبرة سابقة في الجراحة المجهرية بممارسة خطوات توسيع الأبهر الصاعد وخطوات القنية على نطاق واسع قبل محاولة بروتوكول العزل الكامل. ابدأ باستخدام المقص لعمل شق جلدي في خط الوسط لفتح صدر فأر C57 أسود C57 6J مخدر يبلغ من العمر 10 أسابيع من منتصف البطن إلى الفك.

أدخل الصفاق وقم بمسح الحجاب الحاجز عن طريق التشريح الحاد. اقطع القفص الصدري بشقوق على طول جدار الصدر على الجانب الجانبي لكلا الجانبين وقم بقص الوصلات الليفية بين القلب وجدار الصدر. بعد الإزالة الكاملة للقفص الصدري ، استخدم ملقطا صغيرا ومقصا لرفع القلب برفق من القمة التي تكشف الجانب الخلفي للقلب.

لاستخلاص القلب ، قم بتشريح الشريان غير المسمى على الفور على الشريان الأورطي الصاعد وضع القلب على الفور في وسط نضح القلب المثلج. قم بتشريح الأنسجة المتبقية بسرعة لكشف الشريان الأورطي الصاعد واستخدم ملقط ومقص تشريح دقيق لتنظيف المنطقة المحيطة بالشريان الأورطي من الأنسجة الزائدة. استخدم ملقطا ناعما لوضع الشريان الأورطي النظيف على بعد ملليمترين على قنية التروية وتأمين القنية بخياطة حريرية 5-0.

اغسل القلب المقنن بوسط نضح القلب بمعدل تدفق ثلاثة ملليلتر في الدقيقة لمدة أربع دقائق قبل التبديل إلى عازلة الهضم لمدة 15 إلى 17.5 دقيقة. خلال الدقائق الأخيرة من التروية ، اجمع ثمانية ملليلتر من تدفق عازلة الهضم وانقل القلب من القنية إلى طبق استزراع بلاستيكي 60 ملم ، ثم قم بإزالة الأنسجة الزائدة واغمر القلب في 2.5 مل من المخزن المؤقت للهضم. لعزل الخلايا الأذينية ، قم بتشريح الأذينين بعيدا عن القلب وضع الأذينين في طبق استزراع بلاستيكي 30 ملم يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول الهضم.

باستخدام مقص جراحي رفيع الرؤوس ، قم بفرم الأذينين وفصلهما عن بعضهما البعض قبل تشريح الأنسجة باستخدام ملقط رفيع دون تحريك ألياف العضلات أو تفكيكها. باستخدام طرف ماصة نقل معقم ، استمر في خلط الأنسجة وفصلها برفق لمدة 15 دقيقة. كل خمس دقائق ، لاحظ تفكك الخلايا العضلية الأذينية تحت هدف 10X لمجهر برايتفيلد.

عندما يصبح النسيج أكثر هضما، استمر في خلط الأنسجة وفصلها برفق باستخدام طرف ماصة نقل معقمة بحجم مسام أصغر قبل نقل معلق الخلية إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة ملليلترين. اشطف اللوحة مقاس 30 ملم ب 750 ميكرولتر من 37 درجة مئوية لإيقاف الخلايا العضلية العازلة الأولى واجمع المخزن المؤقت مع تعليق الخلية. اسمح للخلايا العضلية الأذينية بالترسيب عن طريق الجاذبية والتحريض اللطيف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

عندما تتشكل حبيبات مرئية ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ونقل المادة الطافية غير المستوية على الخلايا العضلية إلى أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر دون إزعاج حبيبات الخلايا العضلية الأذينية. الطرد المركزي الجزء غير العصبي العضلي وإعادة تعليق الحبيبات غير العصبية العضلية في 10 ملليلتر من DMEM مكملة بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪. بعد العد ، ضع الخلايا غير الخلايا العضلية في الكثافة التجريبية المناسبة لتحليل المصب ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا العضلية الأذينية المعزولة بالتركيز التجريبي المناسب للبذر على ألواح الاستزراع المطلية بالصفيحة.

لعزل الخلايا البطينية ، قم بفرم أنسجة القلب البطينية كما هو موضح للتو لعينة الأنسجة الأذينية وانقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب مخروطي بولي بروبيلين سعة 15 مليلتر يحتوي على 2.5 مل من 37 درجة مئوية للخلايا العضلية التي توقف المخزن المؤقت الأول. اشطف لوحة التشريح ب 2.5 مل من 37 درجة مئوية لإيقاف الخلايا العضلية العازلة الأولى وامزج الغسيل مع تعليق الخلية. باستخدام ماصة نقل معقمة، استمر في خلط الأنسجة وفصلها برفق لمدة أربع دقائق.

في نهاية الحضانة ، استخدم كمية 10 ميكرولتر من الخلايا للتحقق من وجود الخلايا العضلية على شكل قضيب. قم بتمرير تعليق الخلية من خلال مرشح نايلون معقم سعة 100 ميكرولتر إلى أنبوب مخروطي بولي بروبيلين سعة 50 مليلتر واستخدم ملليلترين من محلول الهضم الذي تم جمعه مسبقا لغسل أي خلايا متبقية من مرشح النايلون المعقم. اسمح للخلايا العضلية البطينية بالترسيب عن طريق الجاذبية لمدة ست دقائق مع تحريك لطيف حتى تتشكل حبيبات مرئية في قاع الأنبوب.

باستخدام طرف ماصة معقم ، انقل المادة الطافية غير المحتوية على الخلايا العضلية إلى أنبوب مخروطي بولي بروبيلين سعة 15 مليلتر دون إزعاج حبيبات الخلايا العضلية البطينية وجهاز الطرد المركزي للجزء غير العصي العضلي. أعد تعليق الحبيبات غير العصبية العضلية في 10 ملليلتر من DMEM مع 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية للعد ولوحة الخلايا بالتركيز المناسب لتحليلها في اتجاه مجرى النهر ، ثم أعد تعليق الخلايا العضلية البطينية المعزولة في ملليلترين من الخلايا العضلية التي توقف المخزن المؤقت الثاني للعد. لإعداد نموذج تدريجي لإعادة إدخال الكالسيوم ، أضف 50 ميكرولترا من 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم إلى تعليق الخلايا العضلية البطينية مع خلط شامل لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا إضافيا من 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم إلى الخلايا مع الخلط لمدة أربع دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، عالج الخلايا بحضانة واحدة لمدة أربع دقائق مع 100 ميكرولتر من 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم وحضانة واحدة لمدة أربع دقائق مع 80 ميكرولتر من 10 مللي مولر كلوريد الكالسيوم. بعد الحضانة الأخيرة ، قم بإعادة تعليق الخلايا العضلية البطينية المعالجة بالكالسيوم في حجم مناسب من وسط طلاء الخلايا العضلية البطينية وفقا لتحليلها المخطط له في اتجاه مجرى النهر وزرع الخلايا على ألواح الثقافة المطلية باللامينين.

بعد ساعة واحدة، يستبدل المادة الطافية بوسط الحفاظ على الخلايا العضلية البطينية المكمل ب 25 ميكرومولار بليبيستاتين. تروبونين عضلة القلب T هو علامة على الخلايا العضلية القلبية ويتم التعبير عنه بقوة في كل من مزارع الخلايا العضلية القلبية الأذينية والبطينية. في المقابل ، يتم التعبير عن الببتيد الأذيني والسلسلة الخفيفة للميوسين بقوة وتحديدا في مزارع الخلايا العضلية القلبية الأذينية والبطينية على التوالي.

يتم التعبير عن علامات الخلايا الليفية حصريا في الثقافات غير الخلايا العضلية المعزولة عن كل من الغرف الأذينية والبطينية. يظهر التلوين المناعي للفأر البالغ الأذيني والخلايا العضلية البطينية للفأر البالغ لعلامة الأنابيب التائية ثنائي هيدروبيريدين ومستقبلات الريانودين الأنابيب التائية السليمة طوال فترة العزلة والثقافة طويلة الأمد. يمكن استخدام نمط التصفيف السارمي لتقييم نقاء وصلاحية الخلايا العضلية القلبية المعزولة جنبا إلى جنب مع مورفولوجيا شكل قضيب والتلوين النووي باستخدام TO-PRO-3.

كما هو متوقع ، فإن الخلايا العضلية القلبية البطينية كبيرة ، ويبلغ متوسط طولها حوالي 150 ميكرومتر ، في حين أن متوسط الخلايا العضلية القلبية الأذينية يبلغ حوالي 75 ميكرومتر. علاوة على ذلك ، عند تحليل التلوين المناعي ، تظهر الخلايا العضلية القلبية الأذينية تعبيرا قويا عن الببتيد الأذيني النتريوريك في نمط تلطيخ يتميز بالتوطين في الشبكة الإندوبلازمية والحبيبات الإفرازية. بينما تفرز الخلايا العضلية الأذينية الببتيد الأذيني في ظل الظروف القاعدية ، يزداد الإفراز استجابة للإفرازات.

علاوة على ذلك ، تفرز الخلايا العضلية الأذينية الأذينية الببتيد المغذي للبول الأذيني ويعالج الإفراز المشترك فقط جزءا من الهرمون من حالته السلائف إلى ببتيد المنتج. تشمل الأخطاء الأكثر شيوعا التي يمكن تجنبها عدم الحفاظ على هدوء قبل التضحية ، وعدم إخلاء فقاعات الهواء من نظام التروية ، وعدم التزام الجراح نفسه بالهدوء. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء أي إجراء تجريبي شائع بما في ذلك فحص الفيزيولوجيا الكهربية ومعايير التعامل مع الكالسيوم ، والكيمياء الخلوية المناعية ، والاستجابة الضخامية ، ودراسات الإشارات ، ودراسات إعادة تروية نقص التروية.