ميثيل الحمض النووي الريبي الفحص المناعي لدراسة m⁵C التعديل في arabidopsis

الترسيب المناعي للحمض النووي الريبي الميثيلي ، المعروف أيضا باسم MeRIP ، هو طريقة مصممة لتحديد المجموعات الميثيلية في النسخ الكاملة. يمكن تكييفه مع مستخلصات الحمض النووي الريبي للعديد من الكائنات الحية النموذجية. الطريقة بسيطة ، ولا تتطلب أي معالجة كيميائية قاسية ، ويمكن استخدامها لرسم خريطة لأي تعديل للحمض النووي الريبي طالما متغير محدد.

لاستخراج عينة الحمض النووي الريبي ، قم أولا بطحن 200 ملليغرام من عينة الأنسجة النباتية ذات الأهمية للمسحوق في النيتروجين السائل ، مع الحرص على بقاء الأنسجة مجمدة طوال العملية. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على ثيوسيانات الجوانيدين وحمض الفينول إلى أنسجة النبات الأرضية واخلطها جيدا عن طريق الانعكاس ، مع التأكد من أن جميع الأنسجة مبللة. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي للعينات ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

أضف 200 ميكرولتر من 1-برومو -3-كلوروبروبان إلى المادة الطافية وقم بدوامة العينة بقوة. افصل المراحل عن طريق الطرد المركزي وانقل ما يقرب من 500 ميكرولتر من الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول و 50 ميكرولترا من أسيتات الصوديوم المولارية إلى العينة واخلطها جيدا عن طريق الانعكاس.

احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر قبل ترسيب الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من 80٪ إيثانول ومرة واحدة ب 500 ميكرولتر من 99٪ إيثانول. بعد الغسيل الأخير ، جفف الحبيبات لمدة خمس إلى 10 دقائق قبل إذابتها في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.

قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي وهضم 20 ميكروغراما من عينة الحمض النووي الريبي في محلول DNase والماء والمخزن المؤقت. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، استخدم حجما مناسبا من كاشف تعطيل DNase لإزالة الإنزيم والتحقق من جودة ونقاء الحمض النووي الريبي المعزول عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري وفقا للبروتوكولات القياسية. إذا كان رقم تكامل الحمض النووي الريبي لعينة DNase المهضومة أعلى من سبعة ، فأضف 12 ميكروغراما على الأقل من كل عينة من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد.

0.1 نانوجرام من كل نسخة معدة مسبقا في المختبر ، واحدة ميثيلية وواحدة غير ميثيلة ، لكل ثلاثة ميكروغرامات من عينة الحمض النووي الريبي ورفع الحجم النهائي في كل أنبوب إلى 80 ميكرولتر بماء خال من RNase. ثم صوتنة الحجم الكامل لكل عينة من الحمض النووي الريبي في أنابيب صوتنة فردية وتأكيد كفاءة صوتنة وتركيز عينات الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري. يجب أن يكون متوسط حجم الحمض النووي الريبي المجزأ حوالي 100 نيوكليوتيد.

بالنسبة للترسيب المناعي للحمض النووي الريبي الميثيلي ، أضف تسعة ميكروغرامات من كل عينة من الحمض النووي الريبي الصوتي وما يصل إلى 60 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase في أنابيب فردية جديدة منخفضة الارتباط وقم بتسخين الحمض النووي الريبي إلى 70 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بتبريد العينات لمدة 10 دقائق في حمام ماء مثلج وانقل 20 ميكرولترا من كل عينة إلى أنبوب جديد منخفض الربط لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر كمدخلات. أضف الماء الخالي من RNase إلى 40 ميكرولترا المتبقية من كل عينة إلى حجم نهائي يبلغ 860 ميكرولتر وقسم كل عينة إلى أنبوب واحد منخفض الارتباط للترسيب المناعي وأنبوب ربط منخفض كعينة وهمية.

أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت MeRIP 10X و 10 ميكرولترات من مثبط RNase لكل عينة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من الجسم المضاد ل M5C إلى أنابيب الترسيب المناعي و 10 ميكرولتر من الماء إلى الأنابيب الوهمية. أغلق الأنابيب بالبارافيلم واحتضان العينات لمدة 12 إلى 14 ساعة عند أربع درجات مئوية مع الدوران العلوي.

في صباح اليوم التالي ، أضف 40 ميكرولترا من الخرز إلى أنبوب واحد سعة 15 مليلتر لكل عينة. اغسل الخرزات بثلاث غسلات لمدة خمس دقائق باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت MeRIP والدوران العلوي لكل عينة لكل غسلة ، وجمع الخرزات على مغناطيس بعد كل غسلة للسماح بالتخلص من المخزن المؤقت. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخرزات في 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت MeRIP الطازج لكل عينة وأضف 40 ميكرولترا من الخرز المعلق إلى الترسيب المناعي وأنابيب العينات الوهمية لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية مع دوران علوي.

في نهاية الحضانة ، ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة قبل التخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز. اغسل الخرزات خمس مرات في 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت MeRIP المكمل بنسبة 0.01٪ Tween-20 لمدة 10 دقائق لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة مع الدوران العلوي. بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من محلول الهضم البروتيناز K و 3.5 ميكرولتر من البروتيناز K لمدة ثلاث ساعات عند 50 درجة مئوية مع الرج عند 800 دورة في الدقيقة.

في نهاية الحضانة ، استخرج الحمض النووي الريبي مع 800 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وبروتوكول استخراج كلوروفورم الفينول الجوانيدينيوم ثيوسيانات الحمض كما هو موضح. بعد الاستخراج, أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي المستخرجة في 20 ميكرولتر بالضبط من الماء الخالي من RNase. في هذا الشكل ، يظهر تشغيل تمثيلي لعينة جيدة من الحمض النووي الريبي.

في نفس العينة بعد الصوتنة ، يمكن ملاحظة وجود ذروة واحدة موحدة تحولت إلى اليسار بحجم حوالي 100 نيوكليوتيد. يحدث التركيز المنخفض بسبب فقدان الحمض النووي الريبي أثناء التجزئة وزيادة حجم العينة. يمكن تقييم جودة الترسيب المناعي والعينات الوهمية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

في هذا التحليل التمثيلي ، تم استرداد حوالي 80٪ من النسخة الميثيلية في المختبر في عينة الترسيب المناعي بينما تم استرداد ما يقرب من 2٪ فقط في العينة الوهمية. بالنسبة للتحكم غير الميثيلي ، كان الاسترداد أقل من 1٪ في كل من عينات الترسيب المناعي والعينات الوهمية. بعد التسلسل العميق ومحاذاة القراءات مع الجينوم ، يمكن تطبيق خوارزميات استدعاء الذروة لتحديد النوافذ ذات الدلالة الإحصائية والتي يتم إثرائها في عينات الترسيب المناعي مقارنة بالمدخلات.

باستخدام بيانات التسلسل ، يمكننا تحديد الدافع الذي يحدث عنده مثيلة الحمض النووي الريبي في أغلب الأحيان ويمكن أن يكون هذا الدافع بمثابة طعم لسحب بروتينات ربط معينة.