2D-HELS MS SEQ: طريقة عامة قائمة على LC-MS للتسلسل المباشر والجديد لمخاليط الحمض النووي الريبي مع تعديلات مختلفة على النيوكليوتيدات
يوليو 10, 2020
هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لطريقة التسلسل المستندة إلى LC-MS والتي يمكن استخدامها كطريقة مباشرة لتسلسل الحمض النووي الريبي القصير (<35 nt لكل تشغيل) بدون وسيط (كدنا) ، وكطريقة عامة لتسلسل تعديلات النيوكليوتيدات المختلفة في دراسة واحدة بدقة قاعدة واحدة.
يغطي هذا البروتوكول جميع الخطوات الأساسية اللازمة عند استخدام الطريقة الجديدة التي تم تطويرها لتسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة ، بغض النظر عما إذا كانت عينة الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة أو مختلطة أو معدلة. لا تتأثر الطريقة بالخطأ الأنزيمي أو التكامل الأساسي. يوفر سير عمل مباشرا وحلا عاما يجعل من الممكن تسلسل تعديلات الحمض النووي الريبي المختلفة في وقت واحد بدلا من تعديل واحد محدد في كل مرة.
يمكن تطوير هذه التقنية إلى أداة تشخيصية لتحديد مقاطع الحمض النووي الريبي المميزة لربطها بالأمراض البشرية وأداة دقيقة لدراسة تعديلات الحمض النووي الريبي على المستوى العرضي. لا تعتمد الطريقة على أي طريقة تسلسل سابقة. بدلا من ذلك ، إنه نهج جديد تماما ، ونهدف إلى الوصول إلى طريقة الانتقال لتسلسل أي RNA معدل.
تحتوي بعض أجزاء هذا البروتوكول على جوانب مهمة يمكن نقلها بشكل أكثر دقة عن طريق العرض المرئي ، مثل تسمية 3'end من الحصول على بيانات RNA LC-MS وتحليل البيانات بواسطة برنامج MassHunter. سأشرح هذا الإجراء وأقوم بإعداد LC-MS وقياس عينات الحمض النووي الريبي الخاصة بنا. لإجراء تفاعل وضع العلامات من خطوة واحدة ، اجمع بين 2 ميكرولتر من 150 ميكرومولار AppCp-biotin ، و 3 ميكرولتر من 10x steroide تفاعل meta ، و 1.5 ميكرولتر من عينة 100 ميكرومولار من الحمض النووي الريبي ، و 3 ميكرولتر من DMSO اللامائي ، و 10 وحدات من T4 RNA ligase ، و 19.5 ميكرولتر من المياه المعالجة ب DEPC لحجم إجمالي يبلغ 30 ميكرولترا.
احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية ، ثم قم بتنقية العمود وفقا لتوجيهات المخطوطة. بعد تقسيم الحمض النووي الريبي إلى ثلاثة حصص وإضافة حجم متساو من حمض الفورميك ، احتضان التفاعلات عند 40 درجة مئوية. بمجرد الانتهاء من كل تفاعل ، قم بتجميد العينة على الفور على الثلج الجاف لإخماد تحلل الحمض.
استخدم مكثف فراغ الطرد المركزي لتجفيف العينة لمدة 30 دقيقة تقريبا. أعد تعليق العينات المجففة في 20 ميكرولترا من المياه المعالجة DEPC واجمعها. قم بتخزين العينات على حرارة 20 درجة مئوية حتى قياس LC-MS.
انقل عينة الحمض النووي الريبي إلى قارورة عينة LC-MS بعد تحضير المراحل المتنقلة. يجب أن تحتوي كل حقنة على 100 إلى 400 بيكومول من الحمض النووي الريبي و 20 ميكرولترا. بعد الحصول على البيانات ، استخدم سير عمل استخراج الميزة الجزيئية لاستخراج المعلومات المركبة ، بما في ذلك الكتلة ووقت الاحتفاظ والحجم ودرجة الجودة.
استخدم تنسيق بيانات النقطة الوسطى في إعدادات الجزيئات الصغيرة. اضبط ارتفاع الذروة على 100 على الأقل، ولكن أقل من 1,000، ودرجة الجودة على 50 على الأقل. أخيرا ، قم بتصدير البيانات كملف Excel.
يظهر هنافصل السلم 3 'عن السلم 5's والأجزاء الأخرى غير المرغوب فيها في مخطط وقت للاحتفاظ بالكتلة ثنائية الأبعاد. من الممكن أيضا تسلسل العينات المختلطة التي تحتوي على خيطين من الحمض النووي الريبي بأطوال مختلفة مع ملصق 5 بيوتين في كل حمض رملي متري (RNA). للتمييز بين اليوريدين والسودودوريدين ، تم التعامل مع الحمض النووي الريبي ب CMC ، والذي يحول pseudouridine إلى مقرب CMC-pseudouridin.
المقرب له كتلة مختلفة في اليوريدين ويمكن تمييزه في 2D-HELS MS SEQ. تم استخدام ملف تعريف HPLC للمنتج الخام للتفاعل الذي يحول pseudouridine إلى CMC-adduct لحساب النسبة المئوية للتحويل ، والذي كان 42٪ تم تسلسل خليط من خمسة خيوط مختلفة من الحمض النووي الريبي بواسطة نهج 2D-HELS MS Seq مع وضع العلامات 3'end وتطبيعها من أجل تصور أفضل لتسلسلات الحمض النووي الريبي المتعددة. بدون التطبيع ، سيتم مزدحم رموز الحروف لتسلسلات الحمض النووي الريبي الخمسة معا.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، قم بإعداد تفاعل الملصقات بعناية للحصول على عائد مرتفع من عينات الحمض النووي الريبي المصنفة. أيضا ، راقب بعناية وقت التحلل لإنشاء سلالم جماعية موثوقة وجمع أكبر قدر ممكن من العينات المجففة مع 20 ميكرولتر من الماء. السؤال الذي يمكن طرحه بعد تنفيذ هذا البروتوكول هو كيفية زيادة العرض والطول ومعدل النقل لطريقة التسلسل.
يمكن أن تساعد خوارزمية أفضل وأداة أكثر تقدما بدقة وحساسية أعلى. بعد تطوير هذا البروتوكول ، أصبح من الممكن تسلسل مجموعة واسعة من عينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على كل من النيوكليوتيدات الأساسية والمعدلة دون أي خطأ يتعلق بتسلسل الحمض النووي الريبي القائم على CDA.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة تسلسل جديدة للحمض الريبي النووي (RNA) القصير تعتمد على تقنية LC-MS، والتي تلغي الحاجة إلى وسيط cDNA. يسمح هذا البروتوكول بالتسلسل المتزامن لمختلف تعديلات RNA بدقة القاعدة الواحدة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing)
- علم الترانسكريبتوميات فوق الجينية (Epitranscriptomics)
- التكنولوجيا الحيوية
خلفية علمية
- تعتمد طرق تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) الحالية غالباً على وسائط من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA).
- يمكن للأخطاء الإنزيمية أن تؤثر على دقة التسلسل.
- يعد التسلسل المتزامن لتعديلات الـ RNA أمراً صعباً.
- يعد فهم تعديلات الـ RNA أمراً بالغ الأهمية لدراسة الأمراض البشرية.
الغرض من الدراسة
- لتقديم طريقة تسلسل مباشر للـ RNA.
- لتمكين دراسة تعديلات متعددة في الـ RNA ضمن تحليل واحد.
- لتوفير أداة موثوقة لأبحاث الإبيترانسكريبتوميكس.
الطرق المستخدمة
- تقنية التسلسل القائمة على LC-MS.
- التسلسل المباشر للحمض الريبي النووي (RNA) أحادي السلسلة، أو المختلط، أو المعدل.
- إلغاء خطوة تخليق cDNA.
- سير عمل مصمم لتحقيق دقة وإحكام عاليين.
النتائج الرئيسية
- نجحت هذه الطريقة في تسلسل الحمض الريبي النووي (RNA) القصير (أقل من 35 nt) دون الحاجة إلى cDNA.
- تم تحقيق الكشف المتزامن عن تعديلات مختلفة في RNA.
- أظهرت التقنية مرونة في مواجهة الأخطاء الإنزيمية.
- تم تحديد تطبيقات محتملة في تشخيص الأمراض البشرية.
الاستنتاجات
- قد تصبح طريقة التسلسل الجديدة هذه معياراً لتحليل RNA المعدل.
- إنها توفر نهجاً شاملاً لدراسة تعديلات RNA.
- لهذا البروتوكول تداعيات على الأبحاث المستقبلية في بيولوجيا RNA.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح طريقة تسلسل RNA القائمة على تقنية LC-MS التسلسل المباشر والمبتكر (de novo) لمزيج RNA المعدل دون الحاجة إلى تخليق cDNA، مما يعالج عقبة رئيسية في التحقق من أهداف علم النسخ فوق الجيني (epitranscriptomics). ومن خلال توفير بيانات تسلسل كمية ومحددة للتعديلات، تدعم هذه الطريقة الاكتشاف المبكر للمؤشرات الحيوية القائمة على RNA وتقليل المخاطر الميكانيكية للأوليغونوكليوتيدات العلاجية. كما يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في تحديد المركبات الرائدة من خلال تقديم مخرجات محددة للتعديلات ومؤكدة بالتسلسل، وهي قابلة للتطبيق المباشر في سير عمل الفرز وتطوير المقايسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال التسلسل المباشر لتعديلات RNA، مثل pseudouridine و 5-methylcytosine، في سياقاتها الطبيعية.
- القيمة التشغيلية: توفر حلاً عاماً للكشف المتزامن عن النوكليوتيدات القياسية والمعدلة، مما يقلل الحاجة إلى إجراء مقايسات متسلسلة خاصة بكل تعديل.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في الأهداف من خلال الارتباط المباشر بين زمن الاحتفاظ بالكتلة للقواعد النوكليوتيدية المعدلة، مما يسهل رسم خرائط دقيقة للتعديلات المحددة في مواقعها.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يولّد مخرجات كمية للكتلة وزمن الاستبقاء تتيح تمييزاً موثوقاً لتسلسلات RNA في مخاليط تحتوي على ما يصل إلى 12 من قليلة النوكليوتيد (oligonucleotides) المتميزة.
- القيمة التشغيلية: يوفر بيانات قابلة للتكرار وجاهزة للتقييس (normalization)، متوافقة مع أنظمة LC-MS القياسية عالية الدقة، مما يدعم توحيد المقايسات عبر لوحات RNA القصيرة.
- القابلية للتوسع: يسهل تحضير أنظمة بيولوجية مصادق عليها لعمليات الفحص اللاحقة من خلال إنتاج معايير RNA تم التحقق من تسلسلها وبأنماط تعديل محددة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يدعم التحقق من تسلسل قليلة النوكليوتيدات (oligonucleotides) من الحمض النووي الريبوزي (RNA) العلاجية المعدلة، مما يربط التعديلات في مرحلة الاكتشاف بتقييم المرشحين في المرحلة قبل السريرية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتيح الكشف عن إزاحات الكتلة الناجمة عن التعديلات (مثل مضاف CMC-pseudouridine) للتمييز بين الإشارة الحقيقية والشوائب الناتجة عن التحلل في العينات المعقدة.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يوفر تأكيداً للتسلسل دون انحياز إنزيمي، مما يقلل من السلبيات الكاذبة في فحص التعديلات ويعزز موثوقية قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go).
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر كأداة تسلسل أولية لتحليل RNA القائم على الفرضيات، مما يساهم في تحديد المركبات الواعدة من خلال تأكيد التسلسل وحالة التعديل لأهداف RNA الاصطناعية أو الداخلية قبل إجراء الفحص الوظيفي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تقديم أدلة مباشرة على تتابع RNA وتزامن حدوث التعديلات في المخاليط الأصلية أو الاصطناعية.
- المسح: تمكن من جاهزية المقايسة عبر توليد سلالم زمن الاحتجاز والكتلة التي تعمل كمراجع كمية لتعديلات RNA المستحثة بالمركبات أو تحديد سمات التحلل.
- التحليلات: تنتج بيانات السمات الجزيئية القائمة على المركز (الكتلة، زمن الاحتجاز، الحجم، درجة الجودة) والقابلة للتصدير إلى Excel، مما يتيح المقارنة عبر الظروف المختلفة والتقييم الإحصائي لاستقرار التعديلات.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال توفير معايير RNA معدلة ومحققة التتابع، وتكون مناسبة لمحاذاة المؤشرات الحيوية والتحقق الوظيفي في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كقدرة قائمة على LC-MS قابلة لإعادة الاستخدام للتسلسل السريع لمتغيرات RNA القصيرة (أقل من 35 nt)، مما يقلل الاعتماد على خدمات التسلسل الخارجية ويسرع دورات مسح التعديلات الداخلية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال القضاء على الأخطاء الناتجة عن cDNA وتمكين الملاحظة المباشرة لبصمات الكتلة الخاصة بالتعديلات.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار من خلال خطوات التوسيم الموحدة، والإخماد الحمضي، والتطبيع التي تقلل من التباين بين عمليات التشغيل في مخاليط RNA المعقدة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين التسلسل الداخلي لـ RNA المعدل، مما يقلل الاعتماد على الموردين الخارجيين ويسرع دورات التكرار في تحسين الرائد.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال تقديم بيانات تسلسل وتعديل غير غامضة، مما يقلل من الاستنزاف في المراحل المتأخرة بسبب عدم اكتشاف عدم تجانس RNA أو التوصيف الخاطئ.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في التعامل مع RNA، وتشغيل LC-MS، واستخراج الميزات الجزيئية القائمة على MassHunter لضمان دقة تفسير البيانات.
- تعتمد على توفر أنظمة LC-MS عالية الدقة القادرة على الحصول على بيانات centroid مع تحديد عتبات لارتفاع القمة (100–1000) ودرجة الجودة (≥50).
- تستلزم توحيداً قياسياً بين الفرق في كفاءة الوسم، وتوقيت التحلل، وبروتوكولات التطبيع لضمان توليد سلم كتلة متسق عبر المستخدمين والمنصات المختلفة.
- تتضمن اعتبارات التكيف عند التوسع لما هو أبعد من RNA القصير (<35 nt) أو عند استخدام عينات بيولوجية معقدة، وذلك بانتظار التحسينات المستقبلية في الخوارزميات والأجهزة.
- تنطوي على قيود عملية تشمل قيود الإنتاجية الحالية والاعتماد على التحسين اليدوي لتفاعلات الوسم (مثل AppCp-biotin وT4 ligase وDMSO) لزيادة الحصيلة ودقة السلم لأقصى حد.
