التنشيط البصري الوراثي للمسارات الوراثية في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات بواسطة التخدير المتطاير
July 23rd, 2020
يمكن استخدام شرائح الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة للمدخلات القريبة. يتم استخدام علم البصريات الوراثي لتنشيط القشرة المهادية والقشرية بشكل مستقل إلى القشرة المخية الجديدة غير الأولية ، ويتم تعديل الاستجابات المشبكية والشبكة باستخدام الأيزوفلوران.
يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق فيما إذا كانت التخدير المتطاير يعطل بعض الملخصات أكثر من غيرها، لتحديد ما إذا كانت آثارها من نوع الخلية أو محددة المسار، ولتحديد التأثيرات التي تحدث على مستوى السكان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الخصوصية التي يمكننا من خلالها تقييم آثار التخدير المتطاير. يمكننا استهداف مسارات وأنواع خلايا محددة في فحص النشاط السكاني في وقت واحد.
ابدأ بإعداد كتلة الأنسجة للتقسيم. ارفع الدماغ برفق من تجويف الجمجمة وضعه على ورق الترشيح. قم بعمل قطع على طول المستوى السهمي للدماغ الموازي لخط الوسط وضع كتلة الأنسجة على هذا المستوى السهمي.
قم بتوجيه ورقة الترشيح فوق قالب الحظر ، وقم بمحاذاة الدماغ مع مخطط القالب الأساسي. قم بعمل قطع متوازي في المستوى الإكليلي كما هو موضح في الخطوط الموجودة على القالب ، مع إضافة قطرة صغيرة من تقطيع aCSF للحفاظ على ورق الترشيح رطبا إذا لزم الأمر. ضع كتلة الأنسجة في أربع درجات مئوية لتقطيع aCSF وقم بتطبيق كمية صغيرة من الغراء على مرحلة العينة الباردة.
ارفع كتلة الأنسجة من قطع aCSF وتخلص من المحلول الزائد بزاوية من منشفة ماصة. قم بلصق المستوى الإكليلي الخلفي لكتلة الأنسجة بمرحلة العينة مع مواجهة السطح الظهري للدماغ لشفرة الياقوت. اجمع شرائح الدماغ الإكليلية بسمك 500 ميكرومتر وضعها على شبكة من النايلون في 34 درجة مئوية لتقطيع aCSF.
اترك الحاوية تصل إلى درجة حرارة الغرفة. لتحضير أكياس aCSF التجريبية مع الأيزوفلوران المذاب ، أضف 600 مل من aCSF التجريبي و 600 مل من خليط غاز 95٪ أكسجين و 5٪ من غاز ثاني أكسيد الكربون إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين فارغ. قم بتسمية عنصر التحكم في الكيس هذا.
أضف 300 مل من aCSF التجريبي إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين آخر ، وقم بتسمية هذا الكيس بالأيزوفلوران. استمر في تحضير كيس الأيزوفلوران وفقا لتوجيهات المخطوطة. قم بتكوين بروتوكولات محاكاة الضوء عن طريق تعيين نماذج الموجة بشكل عشوائي لكل ملف تعريف.
يتوافق كل ملف تعريف مع شكل الموجة المخصص له مع نبضة تشغيل واحدة من مدخل TTL رقمي أو تجربة واحدة. عند الانتهاء، احفظ تسلسل ملف التعريف. لوضع المسبار متعدد القنوات في شريحة أنسجة المخ خارج الجسم الحي ، قم بنشر aCSF التجريبي الفقاعي بسرعة ثلاثة إلى ستة ملليلتر في الدقيقة ، وانقل شريحة الدماغ التي تحتوي على منطقة الاهتمام إلى الشبكة الشبكية في غرفة التروية المجهرية.
قم بتثبيت شريحة الدماغ بقيثارة بلاتينية. قم بتدوير الشبكة بحيث يكون خط ملامسات القطب الكهربائي على الطرف البعيد للمسبار متعدد القنوات عموديا تقريبا على سطح التقشير. تحت إضاءة المجال الواسع والتحكم الدقيق في المعالج الدقيق ، قم بخفض المسبار متعدد القنوات باتجاه سطح الشريحة.
قم بتشغيل مكعب المرشح المناسب لتصور بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه في المحطات المحورية للوافدين القشريين. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار بدقة أكبر مع سطح القشرة. ضع المسبار فوق مستوى الشريحة مباشرة على بعد 200 ميكرومتر من موضع الهدف النهائي على طول المحور السيني ، مع ترك قناة واحدة على الأقل خارج منطقة الأنسجة التي يتم تسجيلها.
أدخل المسبار ببطء في الشريحة على طول محورها الطولي. لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، قم بتقدم المسبار فقط إلى الحد الذي تكون فيه الأطراف الحادة مرئية أسفل سطح الأنسجة. قم بتبديل مصدر aCSF التجريبي إلى محلول التحكم المعبأ في أكياس وحدد الخلية ذات العلامات الفلورية لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف.
قم بتقييد الفتحة إلى أصغر قطر وقم بإشراك هدف الغمر في الماء عالي الطاقة ، مع الحرص على تجنب التلامس بين المسبار متعدد القنوات والعدسة الموضوعية. اجعل الأنسجة في بؤرة التركيز. قم بتوسيط الضوء على منطقة من الأنسجة المجاورة للمسبار متعدد القنوات ولكن لا تتداخل معه.
قم بتشغيل مجموعة المرشحات المناسبة للسماح بتصوير الخلايا التي تعبر عن علامة الفلورسنت المعتمدة على Cre. ارفع العدسة الموضوعية لتوفير مساحة واسعة لخفض ماصة التصحيح. قم بتحميل ماصة التصحيح بمحلول داخلي وقم بتثبيتها على حامل القطب.
استخدم حقنة سعة مليلتر واحد لتطبيق ضغط إيجابي يتوافق مع حوالي 0.1 ملليلتر من الهواء. اخفض ماصة التصحيح في المحلول مع التركيز على الطرف تحت التوجيه البصري، واحصل على تسجيل خلية كاملة من الخلية المستهدفة. عبرت المستخدمة في هذا البروتوكول عن بروتين مراسل الفلورسنت tdTomato إما في الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية للسوماتوستاتين أو البارفألبومين.
تم استهداف هذه الخلايا العصبية الداخلية لتثبيت الرقعة تحت التوجيه البصري مع إشراك مكعب المرشح المناسب. لوحظت إمكانات ما بعد المشبكي في الخلايا العصبية الداخلية استجابة لقطار من أربع نبضات من الضوء مللي ثانية. كما تم تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية.
تم استخراج كثافة المصدر الحالية ونشاط الوحدات المتعددة من إمكانات الحقل المحلي. زادت سعة أحواض التيار المستخرجة من كثافة المصدر الحالي كدالة لشدة الضوء. كانت المعادلة اللوجستية غير الخطية ثلاثية المعلمات مناسبة للبيانات للمقارنات عبر المسارات.
زادت سعة إمكانات ما بعد المشبكي أيضا مع سعة الحوض الحالي. تم قياس الاستجابات المشبكية لمدخلات المهاد القشرية والقشرة القشرية أثناء ظروف التحكم والأيزوفلوران والتعافي. تم قمع الاستجابات اللاحقة المشبكية للسوماتوستاتين والمحفزات القشرية القشرية وأحواض التيار المستحثة في ظروف الأيزوفلوران.
عند تحضير شرائح الدماغ ، يعد الحفاظ على صحة الأنسجة أمرا بالغ الأهمية. من المهم الحفاظ على برودة الأنسجة طوال عملية التقطيع ، والعمل بسرعة دون الإضرار بالأنسجة. يمكن معالجة التسجيلات متعددة القنوات خارج الخلية بعد ذلك بعدة طرق.
على سبيل المثال، تعمل تصفية التمرير العالي لإشارة النطاق العريض على عزل نشاط الارتفاع السكاني بينما تبرز حسابات كثافة المصدر الحالية النشاط المشبكي. سمحت لنا هذه التقنيات معا باستكشاف تأثيرات التخدير على مكونات معزولة محددة من الدوائر القشرية ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات الكامنة وراء فقدان الوعي في الجسم الحي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة شرائح الدماغ ex vivo للتحقيق في تأثيرات التخدير المتطاير، وخاصة الأيزوفلوران، على استجابات الخلايا العصبية للمدخلات الواردة. باستخدام التكنولوجيا البصرية الجينية، يقوم الباحثون بتفعيل الواردات المهاد القشرية والواردات القشرية القشرية بشكل مستقل في القشرة الجديدة غير الأساسية، واستكشاف كيفية تعديل التعرض للتخدير الاستجابات المشبكية والشبكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربائية
- اللدونة المشبكية
الخلفية
- فهم كيفية تأثير التخدير المتطاير على الدوائر العصبية أمر بالغ الأهمية.
- توفر شرائح الدماغ ex vivo بيئة خاضعة للسيطرة لمثل هذه الدراسات.
- تتيح التكنولوجيا البصرية الجينية التفعيل المحدد للمسارات العصبية.
- يمكن أن تخبر تأثيرات التخدير على الاستجابات المشبكية بالتبعات الأوسع للتخدير في البيئات السريرية.
هدف الدراسة
- لتحديد ما إذا كان للتخدير المتطاير تأثيرات متفاوتة على المسارات المشبكية المختلفة.
- لتقييم ما إذا كانت هذه التأثيرات خاصة بأنواع معينة من الخلايا.
- لتقييم الاستجابات على مستوى السكان أثناء التعرض للتخدير.
الطرق المستخدمة
- كانت المنصة الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة تتضمن شرائح الدماغ ex vivo من الحيوانات.
- وشملت أنواع الخلايا المستهدفة الخلايا العصبية الداخلية الموجبة للسوماتوستاتين والبارفاألبومين.
- تم تحضير شرائح الدماغ والحفاظ عليها في ظروف تقلل من تلف الأنسجة.
- وشملت التجارب التحفيز البصري الجيني لقياس الإمكانات بعد المشبكية.
- وشملت الخطوات الحاسمة إعداد المحاليل التجريبية وتكوين بروتوكولات التحفيز الضوئي.
النتائج الرئيسية
- قمعت التعرض للأيزوفلوران الاستجابات المشبكية للمدخلات المهاد القشرية والواردات القشرية القشرية.
- ارتفعت سعة الإمكانات بعد المشبكية مع شدة الضوء، مما يشير إلى استجابة الخلايا العصبية المستهدفة.
- أبرزت حسابات كثافة مصدر التيار نشاطًا مشبكيًا معززًا في ظل ظروف معينة.
- تشير النتائج إلى تأثيرات واضحة للتخدير على الاستثارة العصبية والتعديل المشبكي.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة فائدة شرائح الدماغ ex vivo لفحص تأثيرات التخدير على الدوائر العصبية.
- توفر الدراسة رؤى حول الديناميات المشبكية المتأثرة بالتخدير المتطاير، مما يسهم في فهم أعمق للآليات العصبية تحت تأثير التخدير.
- قد تساهم النتائج في توجيه الممارسات السريرية المتعلقة بالتخدير وتأثيراته على وظائف الدماغ.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise dissection of anesthetic effects on defined neural pathways and cell types, supporting mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By isolating thalamocortical and corticocortical inputs in ex vivo brain slices, it provides quantitative, pathway-specific readouts that enhance target validation confidence. The approach aids in predicting how CNS-active compounds modulate network excitability and synaptic transmission, informing early go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether volatile anesthetics differentially affect synaptic pathways.
- Operational Value: Enables cell type- and pathway-specific assessment of drug effects on neuronal excitability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with selective modulation of thalamocortical versus corticocortical transmission.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with quantifiable extracellular and intracellular responses to afferent stimulation.
- Reproducibility: Standardizes optogenetic stimulation and anesthetic delivery via aCSF for consistent synaptic response measurements.
- Scalability: Supports multi-condition testing (control, drug, recovery) to enable dose-response and time-course profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thalamocortical circuits implicated in consciousness and sensory processing, aligning with neuropsychiatric indications.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving key physiological properties of cortical networks.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into anesthetic-induced suppression of postsynaptic potentials, informing safety pharmacology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a platform to evaluate CNS compound effects on defined neural circuits before in vivo testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathway-specific drug actions and biological de-risking of synaptic targets.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable postsynaptic potential and current source density outputs.
- Analytics: Enables comparison of synaptic responses across conditions using non-linear logistic fitting of light-intensity response curves.
- Translational Research: Maintains cortical circuit integrity to support extrapolation to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening anesthetic and non-anesthetic CNS modulators on isolated afferent pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating cell type-specific effects of volatile anesthetics on synaptic transmission.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue preparation, optogenetic stimulation, and anesthetic delivery in aCSF.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether compounds preferentially disrupt thalamocortical or corticocortical signaling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on pathway-selective modulation of interneuron activity in sensory cortex.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electrophysiology, and brain slice preparation.
- Depends on fluorescence-guided patch clamping and multi-channel extracellular recording systems.
- Necessitates precise control of anesthetic concentration in aCSF and light stimulation protocols.
- Involves adaptation considerations when translating findings across species or disease models.
- Limited by tissue viability duration and the need to maintain physiological conditions throughout experimentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
