التنشيط البصري الوراثي للمسارات الوراثية في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات بواسطة التخدير المتطاير

يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق فيما إذا كانت التخدير المتطاير يعطل بعض الملخصات أكثر من غيرها، لتحديد ما إذا كانت آثارها من نوع الخلية أو محددة المسار، ولتحديد التأثيرات التي تحدث على مستوى السكان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الخصوصية التي يمكننا من خلالها تقييم آثار التخدير المتطاير. يمكننا استهداف مسارات وأنواع خلايا محددة في فحص النشاط السكاني في وقت واحد.

ابدأ بإعداد كتلة الأنسجة للتقسيم. ارفع الدماغ برفق من تجويف الجمجمة وضعه على ورق الترشيح. قم بعمل قطع على طول المستوى السهمي للدماغ الموازي لخط الوسط وضع كتلة الأنسجة على هذا المستوى السهمي.

قم بتوجيه ورقة الترشيح فوق قالب الحظر ، وقم بمحاذاة الدماغ مع مخطط القالب الأساسي. قم بعمل قطع متوازي في المستوى الإكليلي كما هو موضح في الخطوط الموجودة على القالب ، مع إضافة قطرة صغيرة من تقطيع aCSF للحفاظ على ورق الترشيح رطبا إذا لزم الأمر. ضع كتلة الأنسجة في أربع درجات مئوية لتقطيع aCSF وقم بتطبيق كمية صغيرة من الغراء على مرحلة العينة الباردة.

ارفع كتلة الأنسجة من قطع aCSF وتخلص من المحلول الزائد بزاوية من منشفة ماصة. قم بلصق المستوى الإكليلي الخلفي لكتلة الأنسجة بمرحلة العينة مع مواجهة السطح الظهري للدماغ لشفرة الياقوت. اجمع شرائح الدماغ الإكليلية بسمك 500 ميكرومتر وضعها على شبكة من النايلون في 34 درجة مئوية لتقطيع aCSF.

اترك الحاوية تصل إلى درجة حرارة الغرفة. لتحضير أكياس aCSF التجريبية مع الأيزوفلوران المذاب ، أضف 600 مل من aCSF التجريبي و 600 مل من خليط غاز 95٪ أكسجين و 5٪ من غاز ثاني أكسيد الكربون إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين فارغ. قم بتسمية عنصر التحكم في الكيس هذا.

أضف 300 مل من aCSF التجريبي إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين آخر ، وقم بتسمية هذا الكيس بالأيزوفلوران. استمر في تحضير كيس الأيزوفلوران وفقا لتوجيهات المخطوطة. قم بتكوين بروتوكولات محاكاة الضوء عن طريق تعيين نماذج الموجة بشكل عشوائي لكل ملف تعريف.

يتوافق كل ملف تعريف مع شكل الموجة المخصص له مع نبضة تشغيل واحدة من مدخل TTL رقمي أو تجربة واحدة. عند الانتهاء، احفظ تسلسل ملف التعريف. لوضع المسبار متعدد القنوات في شريحة أنسجة المخ خارج الجسم الحي ، قم بنشر aCSF التجريبي الفقاعي بسرعة ثلاثة إلى ستة ملليلتر في الدقيقة ، وانقل شريحة الدماغ التي تحتوي على منطقة الاهتمام إلى الشبكة الشبكية في غرفة التروية المجهرية.

قم بتثبيت شريحة الدماغ بقيثارة بلاتينية. قم بتدوير الشبكة بحيث يكون خط ملامسات القطب الكهربائي على الطرف البعيد للمسبار متعدد القنوات عموديا تقريبا على سطح التقشير. تحت إضاءة المجال الواسع والتحكم الدقيق في المعالج الدقيق ، قم بخفض المسبار متعدد القنوات باتجاه سطح الشريحة.

قم بتشغيل مكعب المرشح المناسب لتصور بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه في المحطات المحورية للوافدين القشريين. إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار بدقة أكبر مع سطح القشرة. ضع المسبار فوق مستوى الشريحة مباشرة على بعد 200 ميكرومتر من موضع الهدف النهائي على طول المحور السيني ، مع ترك قناة واحدة على الأقل خارج منطقة الأنسجة التي يتم تسجيلها.

أدخل المسبار ببطء في الشريحة على طول محورها الطولي. لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، قم بتقدم المسبار فقط إلى الحد الذي تكون فيه الأطراف الحادة مرئية أسفل سطح الأنسجة. قم بتبديل مصدر aCSF التجريبي إلى محلول التحكم المعبأ في أكياس وحدد الخلية ذات العلامات الفلورية لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف.

قم بتقييد الفتحة إلى أصغر قطر وقم بإشراك هدف الغمر في الماء عالي الطاقة ، مع الحرص على تجنب التلامس بين المسبار متعدد القنوات والعدسة الموضوعية. اجعل الأنسجة في بؤرة التركيز. قم بتوسيط الضوء على منطقة من الأنسجة المجاورة للمسبار متعدد القنوات ولكن لا تتداخل معه.

قم بتشغيل مجموعة المرشحات المناسبة للسماح بتصوير الخلايا التي تعبر عن علامة الفلورسنت المعتمدة على Cre. ارفع العدسة الموضوعية لتوفير مساحة واسعة لخفض ماصة التصحيح. قم بتحميل ماصة التصحيح بمحلول داخلي وقم بتثبيتها على حامل القطب.

استخدم حقنة سعة مليلتر واحد لتطبيق ضغط إيجابي يتوافق مع حوالي 0.1 ملليلتر من الهواء. اخفض ماصة التصحيح في المحلول مع التركيز على الطرف تحت التوجيه البصري، واحصل على تسجيل خلية كاملة من الخلية المستهدفة. عبرت المستخدمة في هذا البروتوكول عن بروتين مراسل الفلورسنت tdTomato إما في الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية للسوماتوستاتين أو البارفألبومين.

تم استهداف هذه الخلايا العصبية الداخلية لتثبيت الرقعة تحت التوجيه البصري مع إشراك مكعب المرشح المناسب. لوحظت إمكانات ما بعد المشبكي في الخلايا العصبية الداخلية استجابة لقطار من أربع نبضات من الضوء مللي ثانية. كما تم تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية.

تم استخراج كثافة المصدر الحالية ونشاط الوحدات المتعددة من إمكانات الحقل المحلي. زادت سعة أحواض التيار المستخرجة من كثافة المصدر الحالي كدالة لشدة الضوء. كانت المعادلة اللوجستية غير الخطية ثلاثية المعلمات مناسبة للبيانات للمقارنات عبر المسارات.

زادت سعة إمكانات ما بعد المشبكي أيضا مع سعة الحوض الحالي. تم قياس الاستجابات المشبكية لمدخلات المهاد القشرية والقشرة القشرية أثناء ظروف التحكم والأيزوفلوران والتعافي. تم قمع الاستجابات اللاحقة المشبكية للسوماتوستاتين والمحفزات القشرية القشرية وأحواض التيار المستحثة في ظروف الأيزوفلوران.

عند تحضير شرائح الدماغ ، يعد الحفاظ على صحة الأنسجة أمرا بالغ الأهمية. من المهم الحفاظ على برودة الأنسجة طوال عملية التقطيع ، والعمل بسرعة دون الإضرار بالأنسجة. يمكن معالجة التسجيلات متعددة القنوات خارج الخلية بعد ذلك بعدة طرق.

على سبيل المثال، تعمل تصفية التمرير العالي لإشارة النطاق العريض على عزل نشاط الارتفاع السكاني بينما تبرز حسابات كثافة المصدر الحالية النشاط المشبكي. سمحت لنا هذه التقنيات معا باستكشاف تأثيرات التخدير على مكونات معزولة محددة من الدوائر القشرية ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات الكامنة وراء فقدان الوعي في الجسم الحي.