النهج الكمية لتسجيل في الجسم العصبي الكلي الجسمية وبثق Organelle في Vesicles كبيرة exopher في C. elegans

يصف هذا البروتوكول مقاربات الكشف عن كميات البثقات الكبيرة التجميعية و/أو العضية (~4 ميكرومتر) التي تنتجها خلايا C. elegans في شكل طاردات غشاءية. نحن نصف السلالات، وظروف النمو، ومعايير التسجيل، والتوقيت، والاعتبارات المجهرية اللازمة لتسهيل تشريح هذه الآلية طرد الحطام.

نحن نميز آليات في الجسم الحي من البثق الكلي والعضدي من الخلايا العصبية عبر عملية تسمى الاستئصال، والبيولوجيا غير مفهومة بشكل جيد وهذا من المرجح أن تكون ذات صلة بانتشار الأمراض العصبية التنكسية. هذه النهج ضرورية لتحقيق التهديف استنساخها من exophers الخلايا العصبية مقذوف وإظهار منصة لتشريح ميكانيكي من التخلص من القمامة الخلوية عن طريق نقل الخلايا العصبية إلى الخلايا المجاورة. تحديد آليات في الجسم الحي لكيفية الخلايا العصبية إخراج المجاميع قد تؤثر في الواقع على تصميم استراتيجيات جديدة للمساعدة في علاج الظروف العصبية الإنسان.

للظروف القاعدية، منزل C.Elegans من نفس العمر البيولوجي في درجة حرارة ثابتة من 20 درجة مئوية. للتصوير الحي للديناميات داخل الخلية وخصائص إكسوبرينسيس، ضع ما يصل إلى 20 حيوانا على وسادة agaros على شريحة المجهر الزجاجي، وشل حركة الحيوانات. ضع بعناية زلة غطاء فوق الديدان المشلولة ووضع الشريحة على خشبة المجهر الفلوري المتبادل.

استخدام هدف 10 إلى 40x لتحديد الطائرة Z المطلوب في برايتفيلد، مع تدوين الملاحظات من تحديد المواقع من الدودة، واتجاه الذيل الرأس، وموقع الفرج، والتي هي معالم لتحديد الخلايا العصبية في وقت لاحق وطارد. البقاء في نفس الطائرة Z، والتحول إلى عرض الفلوريسنس widefield في 10 إلى 40x لمراسل السيتوسوليك المختار، والتمرير داخل محور Z لمراقبة عمق الحيوان والتعبير المفلور في الطائرة المحورية. سيكون للرأس حلقة عصبية فلورية ، وسيحتوي الذيل الأكثر مدببة على واحد إلى اثنين من الخلايا العصبية ذات اللمس الجانبي المرئي.

يمكن أن يساعد التكبير العالي مع عدسة 63x في تحديد حلقة العصب والعمليات العصبية والهيئات سوما. فمن المفيد أولا لتحديد حلقة العصب الموجود في رأس الحيوان والعمليات العصبية الجانبي. للقيام بذلك، تبدأ في رأس الدودة والتمرير ببطء من خلال محور Z لتحديد مستوى العصب حلقة حيث تعلق العمليات العصبية.

مرة واحدة وقد تم تحديد العصب حلقة, في عرض fluorescence اتبع عملية الخلايا العصبية المرفقة بشكلٍ جانبي في الاتجاه الخلفي نحو الفرج, حيث سوف يكون سوما واضح. مرة واحدة في الجسم أو الجسم سوما الجولة هي في التركيز, من المهم تحديد جميع الخلايا العصبية القريبة. لتحديد الخلايا العصبية اللمس, العثور أولا على ALML, ALMR, و AVM سوما, التي ينبغي أن تكون ألمع الإشارات وتتميز بجسم خلية مستديرة في نهاية العملية.

مرة واحدة وقد تم تحديد مكان سوما العصبية في التركيز الأكثر، واستخدام خلية AVM، خلية فينترال، للمساعدة في تعيين التوجه. إذا كانت الخلايا العصبية AVM في نفس الطائرة كما ALM، ثم الحيوان يستريح على جانبها والخلايا العصبية الجانبية هو ALMR. إذا لم تكن الخلايا العصبية AVM في نفس الطائرة كما ALM في السؤال, أقرب خلية عصبية تعمل باللمس إلى الطائرة المحورية هو الخلايا العصبية ALML.

من المفيد أيضًا تحديد الخلايا العصبية PVM ، وهي خلية عصبية تعمل باللمس بالقرب من الذيل. وسوف الطائرة التركيز من PVM تشير إلى ما إذا كانت الخلايا العصبية لمسة الأمامية هو ALML أو ALMR. إذا ALM في السؤال هو في نفس الطائرة كما PVM, ثم الخلايا العصبية التي تعمل باللمس الملاحظة هي الخلايا العصبية ALML.

بعد أن تم تحديد ALM الأكثر تركيزًا وتعيينها ، من المهم تحديد مواقع هيئات سوما الأخرى بالقرب من منطقة الاهتمام وفي جميع طائرات Z ، لعدم خطأها في exophers. مرة واحدة وقد تم تحديد موقع الخلايا العصبية التي تعمل باللمس من الفائدة، و ALMR أو ALML، وتفقد الخلايا العصبية للمجالات ناضحة كبيرة، كبيرة بما يكفي لاعتبارها طارد برعم، الذي هو على الأقل خمس حجم سوما الأصلي. إذا لم يتم ملاحظة أي مجال برعم أو exopher ، قم بفحص المزيد من سوما العصبية للحصول على خيوط رقيقة مرفقة من الجسم سوما.

طاردات المرفقة تميل إلى أن تكون موجودة أقرب إلى سوما الأصلي وفي طائرة Z مماثلة. لتحديد الطارد غير مرتبط، ابحث عن البروتينات الفلورية المطرودة المركزة، والتي غالباً ما تكون أكثر إشراقاً من سوما. على الرغم من أن يصور هنا، هناك واحد exopher كبيرة.

قد يكون هناك أكثر من كيان فلوري واحد من أصل سوما واحد. ابحث عن طاردات غير مرتبط في طائرات محورية مختلفة وفي المنطقة الجانبي البعيد من حيث تم العثور على سوما الأصلية. يبرز الطاردون عادة بعيدًا عن سوما في اتجاه خلفي من عملية الخلايا العصبية.

تحقق من وجود كائنات كروية كبيرة غير متوضعة ويتم تحديدها على أنها سوما الخلايا العصبية. على الرغم من أن الطاردات هي عادة هياكل فيفيائية ، إلا أنها يمكن أن تتدهور بمرور الوقت ، مما يكتسب شكلًا أكثر عدم انتظامًا. البحث عن وجود أحداث ليلية مرصعة بالنجوم ونوبات متعددة من الأحداث exopher.

لتجنب سوء فهم والخروج من الطائرة سوما لطارد، فمن الأهمية بمكان لتحديد جميع الجثث سوما القريبة، حتى somas خارج التركيز في بداية المراقبة. ويمكن ملاحظة سوما الموسعة أو مدببة، ولكن لا ينبغي أن يكون تمديد دون موقع انقباض واضح يسجل كطارد. رفض البراعم الصغيرة التي لم تبلغ خمس حجم سوما في الكم الكم الحادث exopher.

على الرغم من أن النوريات الناضجة يمكن أن تمتد بشكل كبير مع التقدم في السن ، ويمكن أن تهاجر البروتينات الفلورية إلى نهاية هذه الهياكل البعيدة ، لا تحسب نمو النوريات كطاردات. لتحديد الكيانات الفلورسنت التي ليست exophers، تأكد من استبعاد أي يورفلورسين، والتي قد تكون مخطئة للحطام الحويزل الليلي المرصع بالنجوم تحت الفلورسينس واسعة النطاق. لاستبعاد الإشارات الفلورية الجنينية، التبديل بين الفلوريسنس والإضاءة البراقة، والتحقق من ارتباط الإشارة مع البيض داخل الرحم.

يقدم هذا الجدول ملخصًا لمختلف المراسلين عبر عن اتصال الخلايا العصبية الفلورية التي تم استخدامها لمراقبة إنتاج الطارد. الشحنات التي من المعروف أن قذف في exophers تشمل المجاميع مثل Q128، وانصهار من هنتنغتون الإنسان يوسع يكرر polyglutamine، lysosomes GFP الموسومة مع بروتين الغشاء المرتبط الليسوسوم، والميتوكوندريا الموسومة مع مصفوفة المترجمة GFP. لا يتم طرد Cytoplasmic GFP بقوة ، ويتم الاحتفاظ بها بشكل تفضيلي في سوما ، على الرغم من أن GFP يمكن استخدامها لتصور ضعيف exophers.

بشكل عام، إنتاج exopher من قبل MMR العصبية المعبرة mCherry في ظل الظروف القاعدية يبدأ في اليوم الأول من مرحلة البلوغ ويتراوح من حوالي خمسة إلى 25٪ من ALMRs فحصها ضمن الإطار الزمني الرئيسي لإنتاج exopher من يوم واحد إلى ثلاثة الكبار. يمكن أن الضغوط خاصة والانزعاجات الوراثية زيادة كبيرة في إنتاج طارد داخل الخلايا العصبية ALMR. من الأهمية بمكان تحديد موقع جميع الخلايا العصبية القريبة قبل فحص الخلايا العصبية ذات الاهتمام والمنطقة المحيطة بها للنطاقات exopher ، exophers سليمة ، أو أحداث ليلية مرصعة بالنجوم.

عندما كنت مرتاحا مع تحديد يدويا exophers، يمكن استخدام طرق الإنتاجية المحسنة للفحص على نطاق واسع باستخدام التصوير عالية المحتوى، مما يسمح تحليل الجينوم كله وتشريح الطارد الميكانيكي.