الكمية في الوقت الحقيقي PCR التقييم من التعبيرات ميكرورنا في الكلى الماوس مع انسداد الحالب أحادي

هذه الطريقة تجعل من الممكن توفير التعبير ميكروRNA في الكليات من الفئران مع مجموعة واسعة من الحالات المرضية، مثل التليف الكلوي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من تحديد صورة التعبير ميكرورنا بدقة وحساسية عالية باستخدام عملية بسيطة توفر الوقت وتمنع الخطأ التقني. لإجراء الجراحة الصورية، استخدم المقص الجراحي والملاقط لإجراء شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء البريتوني من المثانة إلى الحافة السفلية اليسرى من الأضلاع.

ترطيب اثنين من مسحات القطن مع برنامج تلفزيوني وسحب بعناية الأمعاء إلى الجانب. ضع مسحات مبللة لتحديد الكلى الأيسر والصابب. أغلق الغشاء البريتوني ثم الشق مع 4-0 النايلون.

لأداء انسداد مجرى البول من جانب واحد، أو UUO، وجعل شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء البريتوني كما هو موضح للجراحة صوري. ضع حقنة 2.5 ملليلتر تحت الماوس. ترطيب مسحتين القطن مع برنامج تلفزيوني، ثم سحب الأمعاء بعناية إلى الجانب مع ملاقط ووضع مسحات لتحديد الحالب الأيسر.

استخدم الملاقط لرفع الكلية اليسرى. استخدام 4-0 الحرير لligate الحالب الأيسر في مكانين ما يقرب من سنتيمتر واحد عن بعضها البعض. قطع الحالب عند نقطة مركز الربطين ثم استخدام 4-0 خياطة النايلون لإغلاق الغشاء البريتوني والشق.

بعد قطع الغشاء البريتوني ، كما ثبت من قبل ، ارفعه بالملاقط واستخدم المقص الجراحي لإجراء شق جانبي عند الحافة العليا ، ثم استمر في الشق على طول أدنى حافة من الأضلاع. تحديد الكلية اليسرى وارتجاعها مع برنامج تلفزيوني حتى تتحول الكلى الصفراء والبيضاء. إزالة الكلى عن طريق قطع الشريان الكلوي الأيسر والوريد مع مقص الجراحية ووضعها في طبق بيتري، ثم غسله بعناية مع برنامج تلفزيوني.

قطع الكلى إلى ما يقرب من 10 ملليغرام عينات مع مقص الجراحية والملاقط، ووضع كل قطعة من الكلى في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر الخاصة بها وإغلاق غطاء الأنبوب. وضع عينة من الكلى في التجانس السيليكون وإضافة 700 ميكرولترات من كاشف التحلل فينيل / guanidine القائم على. اضغط ببطء وتحريف المهيج ضد العينة الكلى لتجانسها.

كرر الضغط والالتواء حتى يتم حل العينة تماما في كاشف التحلل. لمزيد من تجانس العينة، نقل lysate متجانسة إلى العمود تدور بيوبولمير وتدور في 14، 000 مرات G لمدة ثلاث دقائق، ثم نقل lysate عجلت إلى أنبوب microcentrifuge غير المستخدمة 1.5 ملليلتر. الجمع بين lysate في أنبوب مع 140 ميكرولترات من الكلوروفورم وغطاء الأنبوب بإحكام.

لخلط اللولب والكلوروفورم، عكس الأنبوب 15 مرة. احتضان العينات لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تدور في 12، 000 مرات G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. دون إزعاج الترسب، نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge، وإضافة 1.5 مرة حجمها من 100٪الإيثانول.

دوامة الخليط لمدة خمس ثوان. قم بتحميل 700 ميكرولترات من العينة على عمود دوران راسي على الغشاء في أنبوب جمع مليلتر. أغلق غطاء العمود وقم بعمّر العمود عند 15000 مرة G لمدة 15 ثانية، ثم قم برمي الـ lysate المُعجَّل في أنبوب التجميع.

غسل العينة جيدا عن طريق إضافة 700 ميكرولترات من غسل العازلة واحدة إلى عمود تدور الغشاء الراسية في أنبوب جمع مليلتر اثنين. ثم كرر الطرد المركزي ورمي بعيدا أنبوب جمع. كرر الغسيل مرتين مع 500 ميكرولترات من عازلة غسل اثنين في غسل.

بعد الغسيل الأخير، تدور العمود تدور الراسية الغشاء في أنبوب جمع مليلتر اثنين في 15، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة ورمي بعيدا lysate عجلت. نقل العمود تدور الراسية الغشاء إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. قم بإذابة إجمالي الحمض النووي الريبي بإضافة 30 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase إلى العمود، وإغلاق غطاء العمود، وتركه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم تدور العمود في 15، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة. نقل العينة التي تحتوي على مجموع RNA إلى أنبوب جديد microcentrifuge على الجليد، وقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي الكلي بواسطة القياس الطيفي. إعداد حل مزيج رئيسي وفقا لاتجاهات المخطوطة وإضافة ثمانية ميكرولترات إلى كل أنبوب من شريط أنبوب ثمانية بئر.

بعد ضبط الكثافة RNA الكلي، ضع 12 ميكرولتر aliquot من إجمالي الحمض النووي الريبي في كل أنبوب وإغلاق الغطاء. جهاز طرد مركزي الأنابيب لمدة 15 ثانية. وضع الأنابيب في الترموسكل واحتضان لهم لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.

عند الانتهاء، على الفور احتضان لهم لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية لتركيب cDNA. نقل cDNA في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge وتمييع 10 مرات مع الماء المقطر. دوامة وطاردة مركزية الأنبوب لمدة خمس ثوان، ثم تنفيذ كمية في الوقت الحقيقي PCR، كما هو موضح في مخطوطة النص.

وقد استخدم هذا البروتوكول لإنشاء نموذج أحادي الجانب انسداد مجرى البول الماوس عن طريق ربط الحالب اليسار في ثمانية أسابيع الفئران الذكور القديمة وزنها 20 إلى 25 غراما. تم عرقلة الحالب تماما من قبل الربط المزدوج مع 4-0 خياطة الحرير. تم جمع الكلى في ثمانية أيام بعد الجراحة.

وأشارت بيانات ميكرورنا qRT-PCR إلى أن مستوى ميكرورنا 3070-3p قد زاد بشكل كبير وانخفضت مستويات ميكرورنا، 7218-5p وmicroRNA 7219-5p في كليتي الفئران UUO مقارنة بالضوابط. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تكرر التواء العينة الكلوية حتى يتم حلها تماما في فينيل / guanidine القائم على كاشف التحلل لتحقيق استخراج الحمض النووي الريبي جيدة.