نموذج مورين للتعرض الجنين لالتهاب الأم لدراسة آثار التهاب المشيمة الحاد على نمو الأمعاء حديثي الولادة

طورنا نموذجا لالتهاب المشيمة لمحاكاة تعرض الجنين لالتهاب الأم (FEMI) دون مضاعفات الكائنات الحية لدراسة آثار FEMI على تطور القناة المعوية للذرية. وهذا يسمح لدراسة الأسباب الميكانيكية لتطوير الإصابة المعوية بعد التهاب المشيمة.

بروتوكول FEMI هذا التحقيق في الآثار طويلة المدى على حديثي الولادة بعد تعرض الجنين لالتهاب الأم. هذا مهم بشكل خاص لتطور التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، أو NEC. تحاكي هذه التقنية الالتهاب المعقم الذي غالبا ما يظهر في التهاب المشيمة السلى ، ويمكن أن يكون لنقص البكتيريا الحية آثار مربكة على الأمعاء النامية والميكروبيوم.

خطوة في هذا البروتوكول هي حقن LPS للحث على FEMI. من المهم للغاية استخدام جرعة LPS مناسبة وأن لا يسبب الحقن صدمة داخل الصفاق للفأر الحمل. ابدأ بتخفيف مخزون LPS من واحد إلى 100 بمحلول ملحي معقم لتركيز عمل يبلغ 20 ميكروغرام لكل ملليلتر.

حقن السدود الحامل في يوم الحمل E15. قم بوزن الفئران مباشرة قبل الحقن لتحديد جرعات LPS المناسبة ، باستخدام حجم مكافئ من المحلول الملحي العادي لحيوانات التحكم. دوامة حل LPS ثلاث مرات لمدة 15 ثانية على ارتفاع.

ثم اسحبها في حقنة سعة مليلتر واحد. استخدم تقنية التقشير لكبح جماح الفأر الحامل ، وتثبيتها في وضع الاستلقاء الظهري. أدخل ما يقرب من ربع إلى نصف إبرة قياس 30 مقاس ثمانية ملليمترات شطبة لأعلى ، تغطي الربع السفلي الأيمن من البطن بزاوية 30 إلى 40 درجة.

اسحب مكبس المحقنة لضمان الضغط السلبي. ثم تابع الحقن في حالة وجود ضغط سلبي. راقبي الفئران لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ثم أعيديها إلى أقفاص لبقية فترة الحمل.

قم بتسليم الجراء عن طريق الولادة المهبلية في E20 ، واسمح لهم بالبقاء مع الأمهات ، وتلقي الأعلاف الإعلانية. احصد الأمعاء في اليوم 14 بعد الولادة. استخدم المقص والملقط لعمل شق عمودي أسفل خط الوسط للبطن ، عبر الجلد والصفاق ، بطول البطن بالكامل.

استئصال الأمعاء الدقيقة من المعدة إلى الأعور ، وإزالة المساريق. اعزل الثلث البعيد من الأمعاء الدقيقة ، وتخلص من الأمعاء الدقيقة القريبة والأعصور والقولون. قسم جزء الدقاق إلى نصفين باستخدام المقص.

ثم ضع النصف القريب في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي لقياس كمية الحمض النووي الريبي والنصف البعيد في الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لإعداد الشرائح. قسم الأنسجة المضمنة في البارافين إلى شرائح بسمك خمسة ميكرومتر ، وقم بتثبيتها على شرائح زجاجية. قم بإزالة الشرائح ، ثم تلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين واليوزين وفقا للإجراءات القياسية.

استخدم الفحص المجهري الضوئي لتقييم إصابة الأمعاء المعممة من قبل محققين منفصلين مصابين بالعمى على مقياس من ثلاث نقاط ، وتقييم سلامة الزغابات والانفصال عن الغشاء القاعدي. قم بتعيين درجة صفر لوصف الغشاء المخاطي الطبيعي. قم بتعيين درجة واحدة لوصف الإصابة الخفيفة ، والتي تشمل تطوير مساحة Gruenhagen تحت الظهارة ، أو التفريغ ، أو الرفع تحت الظهاري التي تقتصر على الصفيحة المخصوصة أو أطراف الزغابات.

قم بتعيين درجة اثنين لوصف الإصابة الشديدة ، والتي يشار إليها بالرفع الظهاري والتفريغ بالسيارة أكبر من نصف الزغابات أو تشويه الزغابات أو تقرح الغشاء المخاطي وتفكك الصفيحة الخاصة. اغمر الشرائح في الزيلين مرتين لمدة 10 دقائق. ثم اشطفها بالإيثانول بنسبة 100٪.

اغمر الشرائح لمدة ثلاث دقائق في 100٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، و 50٪ إيثانول. ثم اغسل الشرائح تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق ، في مواجهة القسم بعيدا عن الماء لمنع فقدان عينة الأنسجة. قم بتصفية محلول البقع الزرقاء من Alcian باستخدام فلتر قهوة قياسي ، واستخدمه لتلطيخ الشرائح لمدة 15 دقيقة.

ثم اغسلها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة دقيقتين. خفف ملليغرام واحد من الحمض الدوري في 200 مل من الماء المقطر المزدوج ، واغمر الشرائح في هذا المحلول لمدة خمس دقائق. بعد غسل لمدة دقيقة واحدة تحت الماء الجاري ، قم بتلطيخ الشرائح بكاشف شيف لمدة 10 دقائق ، واغسلها مرة أخرى لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتلطيخها بالهيماتوكسيلين لمدة دقيقة واحدة ، واغسلها بالماء لمدة دقيقتين. اغمرها في الكحول الحمضي لمدة دقيقة واحدة ، ثم في ماء صنبور سكوت لمدة دقيقة واحدة ، متبوعا بغسلها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة دقيقة واحدة. لتجفيف الشرائح ، اغمس كل شريحة 10 مرات في 70٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، ثم 100٪ إيثانول.

اغمر الشرائح في 100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، متبوعا بغمرها مرتين في الزيلين الطازج لمدة ثلاث دقائق في كل مرة. ضع قطرة من وسط التثبيت على العينة وغطاء في الأعلى. عد خلايا الكأس تحت المجهر.

لكل قطعة من أنسجة الأمعاء ، احسب عدد خلايا الكأس و 500 خلية ظهارية. ثم عبر عن خلايا الكأس كنسبة لكل 100 خلية ظهارية. عد خلايا بانيث.

لكل قطعة من الأنسجة المعوية ، سجل نسبة خلايا بانيث لكل سرداب معوي ، مع حساب 100 سرداب معوي لكل قطعة من أنسجة الأمعاء. يؤدي تعرض الجنين لالتهاب الأم ، أو FEMI ، في اليوم الجنيني 15 إلى فقدان الحمل المعتمد على الجرعة ومعدل الولادة المبكرة المعتمدة على الجرعة. يسبب FEMI إصابة معوية كبيرة عند الولادة وفي ثمانية أسابيع من العمر.

تحدث هذه الإصابة في حالة عدم وجود أي محفزات إضافية للحيوانات ، مما يشير إلى أن FEMI وحدها يعطل التوازن الطبيعي في الأمعاء الفئرانية حديثي الولادة. تم تحديد عدد خلايا الكأس المنتجة للميوسين وخلايا بانيث المنتجة للببتيد المضادة للميكروبات في الثلث البعيد من الأمعاء الدقيقة. وجد أن FEMI عطل التركيب الطبيعي للظهارة المعوية عن طريق إحداث فقدان كلا النوعين من الخلايا ، مقارنة بالحيوانات التي لا تحتوي على FEMI.

للتحقيق في آثار FEMI على الاستجابة الالتهابية لحديثي الولادة ، تم تحديد مجموعة متنوعة من علامات التهاب المصل ، بما في ذلك إنترلوكين -1 بيتا ، وإنترلوكين -10 ، و KCGRO ، وإنترلوكين -6 ، من مصل الجراء مع وبدون FEMI. زاد FEMI بشكل كبير من الشلال الالتهابي لجميع السيتوكينات عند P0. اختلفت الشلال الالتهابي في الأعمار اللاحقة بناء على النقطة الزمنية والسيتوكين. ومن المثير للاهتمام ، أنه كانت هناك مستويات مماثلة من IL6 في P7 إلى P28 في مجموعات FEMI والوهم.

ومع ذلك ، كانت هناك مستويات أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة FEMI عند P56 ، على الرغم من عدم وجود تدخل ثانوي. من الأهمية بمكان إجراء منحنى جرعة LPS الأولي ، حيث يمكن أن يكون للمخزونات المختلفة من LPS فاعليات مختلفة. لقد وجدنا أن نتائج حديثي الولادة تعتمد على جرعة LPS المستخدمة للحث على FEMI.