إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات
June 2nd, 2020
تهدف هذه المنهجية إلى توضيح الآليات التي تقوم بها الإشارات المصفوفة خارج الخلية مثل صلابة الركيزة وتكوين البروتين ومورفولوجيا الخلية بتنظيم النمط الظاهري للخلية Schwann (SC).
يوفر هذا البروتوكول منصة ثقافة الخلية حيث يمكن التحكم بدقة خصائص المصفوفة خارج الخلية مثل صلابة وتكوين البروتين ومورفولوجيا الخلية بطريقة فعالة من حيث التكلفة والهوى. وهذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة ولا تتطلب تدريبا خاصا أو مرافق خاصة. كما أنها متوافقة مع طرق متعددة الكم الخلوي مثل تلطيخ مناعي ولطخة غربية.
هذه التقنية توفر فهم ميكانيكي لبيولوجيا الخلية شوان. مع نظرة إضافية في تصميم المواد الحيوية لتجديد الجهاز العصبي، ويمكن تطبيقه على أي خلايا تعتمد على الرسو. الجزء الأكثر تحديا من هذا البروتوكول، هو الطباعة الدقيقة.
قبل بداية البروتوكول، والطباعة الدقيقة على الركيزة باستخدام فلورسنت للإشارة إلى البروتين للتحقق بصريا من الطباعة النهائية للنقش. تبدأ من خلال خلط بقوة في قاعدة PDMS مقويات والعوامل المعالجة مع طرف ماصة حتى يتم تفريق فقاعات متجانسة داخل الخليط. ثم إزالة الفقاعات مع فراغ desiccation.
ضع قطرة من خليط PDMS المجفف على غطاء مربع أو دائري، وتناوب على غطاء على معطف تدور في 2، 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. احتضان الغطاء في فرن إما في 60 درجة مئوية، لمدة ساعة إلى ساعتين، أو في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. لإعداد الركيزة منقوشة الصغرى، وضع رقاقة السيليكون منقوشة داخل دائرية قطرها 150 ملليمتر من قبل 15 ملليمتر ارتفاع طبق بيتري وصب دي الغاز PDMS على رقاقة.
توطدت PDMS في فرن في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. السماح لPMS لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم استخدام مشرط الجراحية لخفض الطوابع من 30 من قبل 30 ملليمتر المربعات التي تحتوي على أنماط الصحيح مع الحرص على عدم تلف رقاقة السيليكون.
تعقيم الطوابع PDMS وزلات غطاء قابل للضبط عن طريق غمرها في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة. لتأكيد فعالية micropattern، جفف سطح الطوابع PDMS باستخدام تيار الهواء المصفاة والماصات 15 ميكروغرام لكل ملليلتر BSA حل لتغطية الجانب الكامل منقوشة من الطابع. احتضان الطوابع مع حل BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح لامتزاز البروتين، ثم الهواء الجافة الطوابع لإزالة الحل BSA.
استخدم تيار الهواء الذي تمت تصفيته لتجفيف سطح قسائم الغطاء القابلة للتوابل. جعل الجانب منقوشة من الطابع في اتصال المطابقة مع غطاء قابل للتقريب للسماح لSA الامتزاز على سطح غطاء، واضغط بلطف على ختم ضد غطاء لمدة خمس دقائق. فحص micropattern باستخدام المجهر الفلوري مع مرشح FITC.
لطباعة مناطق لاصقة الخلية بدلا من أنماط الفلورسنت استبدال اللامينين لبروتين BSA. إزالة الطوابع من قسائم الغلاف ونقل زلات الغطاء إلى لوحة ستة جيدا معقمة. إضافة ملليلترين من 0.2٪ Pluronic F-127 حل في كل بئر لتغطية سطح زلة الغطاء واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
التعرق حل F-127 وغسل الغطاء زلات خمس مرات مع برنامج تلفزيوني، مرة واحدة مع ثقافة الخلية المتوسطة، ثم بذور الخلايا Schwann في كثافة البذر من 1000 خلية لكل سنتيمتر مربع. بعد 45 دقيقة من بذر الخلية، قم بإزالة خلية ثقافة المتوسطة وغسل الغطاء ينزلق مرتين مع PBS لمنع الخلايا المتعددة من الالتزام بنفس النمط. الحفاظ على الخلايا في بيئة ثقافة الخلية المطلوبة لمدة 48 ساعة قبل القياس الكمي.
لإنشاء ركائز لثقافة الخلية منقوشة بخط لفحص الخلايا المحاذية، قم بعمل الطوابع وفقًا لاتجاهات المخطوطة، وقطعها إلى الأبعاد المطلوبة. إعداد اثنين من أطباق بيتري المغلفة مع سطح PDMS قابل للتضبط كما هو موضح سابقا، وتنفيذ الطباعة الدقيقة لطباعة المناطق لاصقة الخلية منقوشة بخط على أحد الأطباق. بعد إزالة الطوابع، وملء طبق بيتري مع أربعة ملليلتر من 0.2٪ حل F-127 Pluronic واحتضانه لمدة ساعة.
شطف كل جانب من ختم PDMS ثلاث مرات مع 70٪ الإيثانول وتجفيفه بالهواء. قم بتدوير الطوابع PDMS وطباعة منطقة لاصقة الخلية غير المُغَرَد عليها على طبق بيتري الثاني كما هو موضح سابقًا. بعد احتضان الأطباق مع حل F-127، وإزالة الحل وغسل الأطباق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة.
ثم بذور الخلايا على الأطباق، والحفاظ عليها في الظروف المطلوبة لمدة 48 ساعة قبل إعداد lysates. لتحضير الـ 80 من محلول RIPA، أعد وفقاً لاتجاهات المخطوطة، على كل منطقة لاصقة من الخلايا، ثم قم باحتضان الخلايا على كتلة ثلج لمدة 25 دقيقة. كشط الخلايا Schwann مع مكشطة الخلية لمدة خمس دقائق وجمع lysate في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر المسمى.
الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12 آلاف مرة G وأربع درجات مئوية. جمع المغرور ونقله إلى أنبوب تنظيف microcentrifuge. أدّت ركائز لامينين المغلفة إلى ارتفاع معدل الانتشار عند مقارنتها بالكولاجين والركائز المغلفة بالليفي.
وأظهرت خلايا شوان على ركائز مع طلاء اللامينين وتختلف مودولي أن ركائز ليونة نسبيا انخفاض معدلات انتشار الخلايا. كما تم تحليل الخلايا للتعبير البروتيني. تم رفع مستوى العامل النسخي c-Jun التعبير حيث أصبحت ركائز أكثر ليونة.
ومع ذلك ، كان إلى حد كبير downregulated على أنعم ركائز. على ركائز قاسية، الكولاجين ركائز المغلفة أسفرت عن أعلى تعبير ج يونيو، كما أصبحت ركائز ليونة، وأظهرت laminin أعلى مستويات ج يونيو. ثم كانت تلطخت الخلايا مع رودامين-phalloidin لاستكشاف دور انتشار الخلايا ومنطقة في التعبير C-يونيو.
عندما تم إنشاء خطوط لاصقة الخلية على ركائز ثقافة الخلية، وزيادة نسبة الارتفاع النووي للخلايا المصنفة على الركيزة نمط بالمقارنة مع تلك الخلايا على ركائز غير متفرعة. تم رفع تنظيم التعبير عن كل من مستقبلات c-Jun و p75 العصبية في الخلايا الكثيفة مع منطقة انتشار أصغر. كما أدت الخلايا المنقوشة بخط إلى تعبير أعلى لكل من c-Jun و p75 NTR بالمقارنة مع الخلايا غير المُتَرَكَّة.
تم إنشاء هندسات لاصقة الخلايا المطبوعة Microcontact للتحكم بدقة في منطقة انتشار الخلايا وامتدادها مع القضاء على تفاعلات الخلايا. وتسببت زيادة نسبة الارتفاع إلى الارتفاع الخلوي في زيادة المدة النووية. وكان التعبير عن ج يونيو upregulated عن طريق كل من الاستطالة الخلوية وتثبيط انتشار الخلايا.
وأكد تلطيخ الفلوروسين المناعي لكل من النوى والزنبق أن منطقة انتشار الخلايا والتسامي تم التحكم فيها بدقة من خلال هذه الطريقة micropatterning. مهدت هذه التقنية طريقة لاستخدام ركائزنا القابلة للتواؤم كوسيلة لتحليل بيولوجيا خلية شوان بطريقة ميكانيكية والإشارة في سياق التجديد والسرطان.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
توضح هذه المنهجية كيفية تنظيم إشارات المصفوفة خارج الخلية، بما في ذلك صلابة الركيزة، وتكوين البروتين، وشكل الخلية، لنمط خلية شوان. يتيح البروتوكول التحكم الدقيق في هذه الخصائص بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الطب التجديدي
الخلفية
- تلعب خلايا شوان دورًا حاسمًا في تجديد الأعصاب.
- تؤثر خصائص المصفوفة خارج الخلية على سلوك الخلية.
- يمكن أن يؤدي فهم هذه الآليات إلى تحسين تصميم المواد الحيوية.
- هذه الطريقة يمكن الوصول إليها دون تدريب متخصص.
هدف الدراسة
- توفير منصة لدراسة بيولوجيا خلية شوان.
- استكشاف تأثيرات خصائص المصفوفة على نمط الخلية.
- تسهيل التقدم في تجديد الجهاز العصبي.
الطرق المستخدمة
- منصة زراعة الخلايا لخصائص المصفوفة الخاضعة للرقابة.
- الطباعة الدقيقة للتواصل لرسم الأنماط بدقة.
- التلوين المناعي الفلوري لتحديد الكمية الخلوية.
- تحليل البلوت الغربي لتقييم التعبير عن البروتين.
النتائج الرئيسية
- أظهرت تأثير صلابة الركيزة على سلوك خلية شوان.
- حددت تركيبات البروتين الرئيسية التي تؤثر على نمط الخلية.
- قدمت رؤى حول الفهم الميكانيكي لخلايا شوان.
- أظهرت التوافق مع طرق متنوعة لتحديد الكمية الخلوية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة خلايا شوان.
- يمكن أن تفيد الرؤى المكتسبة في تصميم المواد الحيوية لإصلاح الأعصاب.
- تطبق المنهجية على الخلايا الأخرى المعتمدة على الالتصاق.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise control of extracellular matrix properties to mechanistically dissect Schwann cell phenotype specification, a critical step in peripheral nerve regeneration. By decoupling substrate stiffness, protein composition, and cell morphology, it provides a tunable platform for target validation in neuroregenerative drug discovery. The approach supports predictive confidence in lead identification by linking ECM cues to regenerative phenotypic markers such as c-Jun and p75 neurotrophin receptor expression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how ECM stiffness and protein composition regulate Schwann cell dedifferentiation and regenerative phenotype.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess target engagement of compounds aimed at modulating Schwann cell plasticity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cellular morphology and protein expression under defined ECM conditions.
- Operational Value: Compatible with immunofluorescence and western blot, enabling standardized assay development for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by elucidating how biomaterial properties influence Schwann cell behavior relevant to nerve repair.
- Operational Value: Facilitates preclinical model development using tunable substrates to mimic injury microenvironment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of ECM-targeted modulators of Schwann cell phenotype prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating the effects of stiffness and ligand composition on c-Jun and p75 NTR signaling.
- Screening: Delivers assay-ready platforms with controlled cell spreading and elongation for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables including nuclear aspect ratio, cellular elongation, and protein expression levels for statistical comparison.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by informing biomaterial design for peripheral nerve regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability across anchorage-dependent cell types, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ECM-cell signaling.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across labs through defined microcontact printing and substrate tuning protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on Schwann cell regenerative state.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on phenotypic modulation in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microcontact printing and PDMS handling for pattern fidelity.
- Depends on access to spin coaters, vacuum desiccators, and fluorescence microscopy for substrate preparation and validation.
- Necessitates cross-team standardization of seeding densities, incubation times, and quantification methods to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or ECM proteins beyond laminin, collagen, and fibronectin.
- Limited by the technical challenge of microcontact printing, which affects throughput and pattern consistency.
