فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

ومن المعروف smFISH لقياس العدد المطلق كما موقع الخلية الفرعية من mRNAs. لدينا بروتوكول sMFISH اللون اثنين لديه القدرة المضافة لقياس حركية النسخ وتدهور مرنا. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة العديد من العينات في وقت واحد دون وقت إضافي أو جهد.

على سبيل المثال، يمكن معالجة أربع تجارب دورة تدريبية زمنية تسفر عن 48 عينة للتصوير في ثماني ساعات. بروتوكولنا ينطبق على نطاق واسع على العديد من الجينات والأنواع البكتيرية. لإعداد زلات الغلاف والشرائح الزجاجية للتجربة.

استخدام ملقط لوضع غطاء زلات والشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 100٪ الإيثانول ووضع جرة في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية تلبية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. في نهاية sonication غسل الشرائح وغطاء زلات ثلاث إلى أربع مرات مع المياه النقية جدا قبل إعادة ملء جرة مع 70٪ الإيثانول وتكرار sonication. عندما يتم القيام به كل الخطوات sonication، وتجفيف زلات الغطاء والشرائح مع غاز النيتروجين.

ضع الغطاء ينزلق في صندوق تلميح 1000 ميكرولتر ميكرولتر فارغ ووضع الشرائح في مربع شريحة نظيفة. ثم، بعد ثقوب صندوق تلميح ماصة استخدام علامة المياه لرسم الدوائر على زلات الغطاء وتطبيق 20 ميكرولتر قطرة 0.1٪ بولي ل يسين إلى كل من هذه الآبار. لإعداد تجربة دورة زمنية، أضف 750 ميكرولترات من ثقافة الإشريكية القولونية المتنامية بشكل كبير إلى أنبوب ثقافة 1.5 ملليلتر يحمل علامة الوقت صفر.

وعلى الفور عكس الأنبوب. حث التعبير لاك Z مع 0.2 إلى واحد ملليمولار IPTG وبدء جهاز ضبط الوقت. بعد التحقق من جهاز ضبط الوقت، وجمع ثقافة الخلية في كل نقطة زمنية تجريبية متتالية كما أظهرت للتو.

عند نقطة الوقت المناسبة أثناء التجربة، أضف خمسة ملليمولار ONPF إلى القارورة لقمع التعبير الزى اللاك ومواصلة أخذ عينات من الثقافات لتتبع تدهور الرنا. في نهاية الوقت من الحصول على عينة الدورة، احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة تليها حضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الطرد المركزي الحضانة العينات لإزالة المثبت واستخدام ماصة لإزالة فائقة.

إعادة تعليق البكتيريا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني DEPC وغسل الخلايا مرتين أكثر في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخلايا في 30 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة. لـ(أيّد) الخلايا.

أولا إضافة العينة من كل مرة نقطة إلى الآبار الدابيبية على واحد من الايثانول معقمة الزجاج غطاء زلات. وتسمح للخلايا أن تلتزم زلة الغطاء مع حضانة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، إضافة 15 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول إلى كل بئر.

بعد أربع دقائق، يُشعّر الإيثانول من كل بئر حتى تكون الآبار جافة تماماً. بعد الغسيل إضافة 30 ميكرولترات من محلول ما قبل التهجين إلى كل بئر من الخلايا permeabilized، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في فرن 37 درجة مئوية. استبدال حل ما قبل التهجين مع ما يقرب من 30 ميكرولترات من حل التهجين التحقيق في بئر.

وتغطي الغرفة مع رقائق الألومنيوم لمدة ساعتين حضانة في الفرن 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة استخدام ماصة متعددة القنوات لشطف الآبار ثلاث إلى خمس مرات مع 30 ميكرولترات من محلول الغسيل في كل غسل جيد. بعد الغسيل الأخير، احتضان الخلايا لمدة 15 إلى 30 دقيقة في 37 درجة مئوية قبل غسل الآبار خمس مرات مع 30 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة في الغسيل.

بعد الغسيل الأخير، استلهمي كل السائل من زلة الغطاء. وإضافة أربعة microliters من برنامج تلفزيوني DEPC الطازجة إلى كل بئر. استخدام ملقط لوضع بعناية زلة الغطاء على شريحة الزجاج معقمة الإيثانول عينة الجانب أسفل، واستخدام صمغ الأسنان السيليكون لختم حواف زلة الغطاء.

لتحديد موقع منطقة ذات أهمية حدد الوضع المباشر للتصوير على النقيض من المرحلة والمناورة في عصا التحكم في المرحلة لتغيير مجال الرؤية داخل بئر. تقع منطقة فيها كثافة الخلية الأمثل وضبط Z التركيز بحيث صور الخلية النقيض المرحلة في التركيز. ثم الحصول على صورة C خمسة مع التعرض أربع ثوان، وصورة C ثلاثة مع التعرض الثانية والثانية وصورة النقيض من المرحلة مع التعرض 0.2 ثانية لحوالي 10 مناطق مختلفة في البئر.

بدلاً من ذلك، يمكن تشغيل عملية استحواذ على NDI يتم فيها الحصول على صور C5 و C three ومرحلة التباين في سلسلة. عندما تم تصوير كافة الآبار، افتح أداة تجزئة الخلايا المناسبة، وunlick المكدس. تحميل الصور على النقيض من المرحلة من الفائدة وتحديد إطارات مستقلة وانقر فوق حساب المرحلة لمحة صفر.

لبدء عملية التقسيم التي سيتم خلالها تحديد الخلايا وحساب معالمها. قم بتحميل المعلمات المتوفرة في مجلد GitHub وانقر فوق كافة الإطارات. في نهاية معالجة حدد كفاف لتصور شبكة.

المقبل، تحت علامة التبويب الكشف عن البقعة، إلغاء اغزل المكدس، والتحقق من الشبكات وانقر فرك لبدء تحديد بقعة وتحديد كم استنادا إلى اثنين من تركيب د غاوسي. حدد المجلد الذي يحتوي على الصور الفلورسنت وملف الشبكة الذي تم حسابه من إجراء الكشف عن الخلايا فقط، ثم قم بالإشارة إلى اسم الملف الذي سيتم حفظ نتائج الكشف عن البقعة إليه. ثم استخدم سير عمل تحليل الصور المتوفر على GitHub لتحليل الصور المفلورة.

في هذا المجال الكامل للعرض يمكن ملاحظة حوالي 500 خلية الإشريكية القولونية بكثافة جيدة لتجزئة الخلايا. يجب أن تظل مورفولوجيا الخلايا في صور التباين المرحلة مماثلة لتلك الخلايا الحية لأغراض تجزئة. إذا كانت الخلايا أكثر من permeabilized، سوف تصبح مورفولوجيا غير مناسبة للتجزئة.

توزيع كثافة بقعة الز مرنا لاك قبل التعريفي لا يتناسب بشكل جيد مع توزيع عادي أو بواسون بسبب وجود بقع مع كثافة عالية. عندما يتم حث التعبير عن Z لاك يزيد إشارة من خمسة رئيس لاك Z مرنا قبل ثلاثة رئيس لاك Z مرنا زيادة إشارة. إذا تم قمع التعبير عن ز لاك على حد سواء خمسة وثلاثة رئيس لاك Z مرنا إشارات انخفاض.

للحصول على معدل استطالة النسخ ، فإن ارتفاع الإشارات الخمس وثلاثة إشارات رئيسية يتناسب مع الخطوط. بينما يتم الحصول على معدل تحلل مرنا عن طريق تركيب منطقة الاضمحلال مع وظيفة أسية. لأن سمكة جزيء واحد هو تقنية خلية واحدة، يمكن أيضا تحليل الخلية إلى الخلية variabilities في النسخ.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل التحلل من خمسة رئيس وثلاثة رئيس لاك Z مرنا يسمح لكثافة البوليمرات RNA على الجين Z لاك يمكن تحديدها كميا. كما يتم التعامل مع عينات من نقاط زمنية مختلفة في وقت واحد خلال هذا الإجراء. من المهم أن تبقى العينة منفصلة أثناء وجودهم في الأنابيب وعلى زلة الغطاء.

باستخدام هذا جزيء واحد تقنية المجهر الخلية واحدة. يمكن للباحثين الآن استكشاف كيفية النسخ وتحرّر حركية التحلل مرنا ترتبط الأرقام المطلقة أو المواقع دون الخلوية من mRNAs.