عزل الماوس الكلى المقيم CD8⁺ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

تحتوي خلايا CD8+T على ميزات مميزة في الأنسجة المختلفة، كمثال حاسم على الأنسجة غير المخاطية وغير اللمفاوية. من الضروري أن تميز مباشرة الخلايا المقيمة في الكلى لفهم كامل بيولوجيا الخلايا التائية. هنا سوف نبرهن على طريقتنا المريحة لعزل خلايا CD8 + T المقيمة في الكلى التي تستوعب تحليل قياس الخلايا في التدفق اللاحق.

هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة دراسات من الخلايا CD8 + T الأثر والذاكرة ولدت بعد العدوى، فضلا عن الاستجابات المناعة الذاتية. سيتم إجراء العملية من قبل الدكتور تشاويو ما، وهو عالم أبحاث لمختبري. تبدأ عن طريق تخفيف البيوتين المضادة لتكلس CD8 ألفا إلى 15 ميكروغرام لكل ملليلتر في برنامج تلفزيوني، والتأكد من أن هناك ما يكفي لإدارة 200 ميكرولترات لكل فأرة.

قبل الحقن، سخني الوريد الذيل من الفأرة بمصباح حرارة علوي لمدة خمس إلى 10 دقائق لتمدده. رسم 200 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة المخففة قبل إلى حقنة الأنسولين 28 قياس وإزالة أي فقاعات الهواء عن طريق تحريك المكبس صعودا وهبوطا. ثني الإبرة لخلق زاوية 150 درجة بين الإبرة والمحاقن، شطب، بحيث الإبرة موازية للوريد الذيل.

كبح جماح الماوس مع تقييد القوارض ورش الذيل مع 70٪ الإيثانول لجعل الوريد مرئية بوضوح. عقد الذيل في نهاية القاصي مع الإبهام والأصابع الوسطى من اليد غير المهيمنة، ثم وضع السبابة تحت موقع الحقن. مع اليد المهيمنة إدراج الإبرة في الوريد في موازاة اتجاه القلب وحقن ببطء 200 ميكرولترات من الجسم المضاد.

إزالة الإبرة وضغط بلطف موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. بعد القتل الرحيم الماوس، تشريح الكلى مع مقص ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. اترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة.

إعداد لوحات ستة-جيدا مع ثلاثة ملليلتر من حل الهضم في كل بئر, باستخدام بئر واحد لكل فأر, وتخزينها على الجليد. إضافة 300 ميكرولترات من حل الهضم في كل أنبوب عينة و mince عينات الكلى مع مقص الربيع على التوالي. نقل عينات الكلى المفروم إلى لوحات ستة- جيدا مع حل الهضم.

احتضان العينات في 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف لمدة 45 دقيقة، ثم التجانس الأنسجة مع شفة المكبس من حقنة ثلاثة ملليلتر ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. تدور العينات في أسفل 500 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة افرنح و resuspend بيليه في ثلاثة ملليلتر من RPMI مع 10٪ FCS.

تدور أسفل العينة في 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع خمسة ملليلتر من 44٪ كثافة التدرج المتوسطة ومزيج RPMI. وضع غيض من ماصة ثلاثة ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من 67٪ كثافة الانحدار المتوسطة وBBS مباشرة إلى الجزء السفلي من كل أنبوب والإفراج ببطء الحل بحيث يشكل الحل الثقيل طبقة متميزة في الجزء السفلي. قم بتدوير العينات بمعدل 900 مرة من g لمدة 20 دقيقة مع إعدادات المسرع والفرامل المخفضة، ثم قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات.

إزالة الطبقة العليا مع ماصة نقل دون لمس طبقة الخلايا الليمفاوية ونقل طبقة الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني و5٪ FCS، ثم مزيج عن طريق عكس ببطء الأنبوب أربع إلى ست مرات. بعد الطرد المركزي للعينات في 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، وإزالة سوبرنات وإعادة بناء بيليه الخلية مع 500 ميكرولترات من كامل متوسطة RPMI.

الخلايا جاهزة الآن للانطلاق في التلطخ للخلايا. حتى بعد كثافة الطارد المركزي بوساطة الغدد الليمفاوية التخصيب، كان من الشائع جدا أن نرى جزءا كبيرا من الخلايا الليمفاوية غير في المنتج النهائي. ومع ذلك، بعد الحصول على الخلايا الليمفاوية الحية، كان من السهل تحديد الخلايا الليمفاوية CD8 + T.

كما هو متوقع، فقط خارج الأوعية الدموية CD8 + T الخلايا المكتسبة بكفاءة الأنسجة الذاكرة المقيمة T-الخلايا الظاهرية، مثل رفع من CD69 و downregulation من Ly6C. وعلى النقيض من الفئران المصابة، فإن الغالبية العظمى من خلايا CD8 +T المعزولة عن الفئران الساذجة الصغيرة الموجودة في مرفق SPF كانت تحمل اسمًا باجسام مضادة لـ CD8 Alpha وبالتالي فهي تنتمي إلى المقصورة داخل الأوعية الدموية. وقد سرّع هذا الأسلوب إلى حد كبير من التحقيق في الخلايا المناعية المقيمة في الأنسجة في الأعضاء ذات الأوعية الدموية الكثيفة.