نموذج حلقة الدم في المختبرية للتحقيق في التوافق الهيموسيتوفية وتنشيط الخلية المضيفة للأجهزة الطبية الوعائية

يسمح نموذج الحلقة الدموية هذا للباحثين باختبار توافق الهيمو في المختبر لأجهزة الأوعية الدموية مثل أنابيب الضخ أو الدعامات. تحت شروط موحدة. لذلك لا تمارس هذه التقنية أي تأثير على الدم بالقوة الميكانيكية وبالتالي تجنب النتائج المضللة عن طريق التنشيط الجوهري لمكونات الدم.

قبل محاولة تجربة، يجب أن تمارس التجميع الجزء الميكانيكية المناسبة، الكمال حلقة إغلاق بناء نظام وبطء تحميل الدم في الحلقات. لإعداد الجمعية حلقة، واستخدام قاطع أنبوب لقطع 250 سنتيمترا، خمسة ملليمتر قطعة القطر الداخلي من الأنابيب على سطح مستو. ومكونات النهايات المفتوحة للأنابيب في قطعة قصيرة من أنبوب السيليكون تركيب القطر الخارجي للأنبوب التحقيق لتوليد شكل حلقة.

تشديد بعناية المسمار قفل من موصل الفرقة التوتر وضبط قوة الإغلاق بحيث لا توجد فجوة بين الانحناءات اثنين. إذا تم تشديد المسمار قفل تماما والتوتر من الفرقة البولي يبدو منخفضا جدا لسد الفجوة بين الانحناءات اثنين، وفتح نظام القفل وقطع بضعة ملليمترات من الفرقة التوتر. لإعداد تجميع حلقة الدعامة، افتح اثنين من الحلقات واخرج الأنبوب من نظام نطاق التوتر.

ثم أدخل الدعامة في منتصف الأنبوب حسب تعليمات الشركة المصنعة. عندما تم إنشاء العدد المناسب من الحلقات للتجربة تأمين الحلقات في حلقة مهد وحدة التناوب، خارج حمام الماء 37 درجة وإرفاق مهد حلقة إلى وحدة دوران داخل حمام الماء. المقبل، ملء حقنة واحدة 10 ملليلتر لكل حلقتين من الدم ليتم جمعها مع 150 ميكرولتر أو حل مخزون الهيبارين الطازجة واستخدام فراشة قياس 21 لجمع الدم بلطف في المحاقن، مع الحرص على تجنب التماثل أو تنشيط الخلية بسبب الفراغ المفرط.

عندما تم جمع كل الدم نقل الدم إلى كوب الزجاج واستخدام ماصة المصلية خمسة ملليلتر، لخلط بلطف الدم والهبارين. عندما تم الحصول على حل متجانس مع تلميح ماصة لم تدرج بالكامل في الأنبوب، بعناية، ملء كل حلقة مع خمسة ملليلتر من الدم. إغلاق كل حلقة بعد أن تم تعبئة وتأكد من أن الحلقة، الفرقة التوتر، والحامل بشكل صحيح.

ثم تدوير الحلقات لمدة ثلاث ساعات في 30 الثورات في الدقيقة الواحدة. في نهاية التناوب، والسماح لحلقات للوقوف في الرف لمدة دقيقتين للسماح للدم تتراكم في قيعان حلقة قبل فتح بعناية الموصلات وسحب الدم من التكرارات في 10 القاروص الزجاجية الفردية ملليلتر. عندما تم جمع كل الدم شطف كل أنبوب مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني واستخدام مشرط لقطع بعناية عينة سنتيمتر واحد من نهاية كل أنبوب.

احتضان العينات بين عشية وضحاها في 2٪ من الجلوتارالديهيد عند أربع درجات مئوية، تليها حضانة 15 دقيقة و1٪ أوزميوم تتروكسيد في درجة حرارة الغرفة. في نهاية حضانة التيتروكسيد، يجفف العينات في سلسلة الإيثانول التصاعدي لمدة 20 دقيقة لكل تركيز، يليه جفاف 30 دقيقة في الإيثانول 100٪. في نهاية حضانة الإيثانول بنسبة 100٪، دع العينات تجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة قبل تصوير العينات عن طريق مسح المجهر الإلكتروني عند جهد تسارع خمسة كيلوفولت، باستخدام ماسح ضوئي أشعة سينية مقطعية دقيقة.

لتحليل تدفق السيتوميتري لعينات الدم. نقل 100 ميكرولترات من الدم من كل عينة في كل من تسعة أنابيب FACS المليلتر خمسة وإصلاح العينات مع إضافة 100 ميكرولترات من الفورمالديهايد 4٪ السلطة لكل أنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بعد الغسيل ، إعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من خلايا الدم الحمراء العازلة في أنبوب ، لمدة خمس دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة، وغسل العينات عن طريق الطرد المركزي في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب ووضع العينات دون عظمى على الجليد. لإعداد الخرز تعويض وصمة عار واحدة إضافة أربع قطرات من إيجابية وأربع قطرات من الخرز السلبي إلى وحدات التخزين ملليلتر الفردية من FACS العازلة، ودوامة الحلول للحصول على تعليق حبة متجانسة. إضافة 100 ميكرولترات من كل حل إلى كل من أربعة أو خمسة أنابيب المليلتر FACS المسمى كما هو مبين وغسل الخرز مع ملليلتر واحد من عازلة FACS لكل أنبوب.

أضف التالي 100 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة للدوامة المناسبة لكل تجربة ومضين ناقص أنبوب واحد مع خلط لطيف. لمدة 30 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من عازلة FACS الطازجة لكل عينة والكريات resuspend في 250 ميكرولترات من عازلة FACS لكل أنبوب.

قبل تحليل الخرز على عينات الخلايا عن طريق تدفق القياس الخلوي، وفقا للبروتوكولات القياسية. يمكن تصور توزيعات خلايا الدم على السطح بأكمله من bloops اثنين من الربط بواسطة التصوير المقطعي المجهري والمسح المجهري المجهر الإلكتروني في حين لا يتم ملاحظة الجلطات في حلقات مغلقة دون ثغرات. تحليل كامل عدد خلايا الدم، لا تظهر اختلافات كبيرة في أرقام الكريات الخبيثة بين أي من الشروط المختبرة، الصفائح الدموية وأرقام الكريات البيض ومع ذلك، يتم تخفيض كبير في مجموعة حلقة اللاتكس ويتم زيادة أعداد الهيموغلوبين الحرة بشكل كبير، مما يدل على ضعف جدا التوافق الحيوي من اللاتكس.

في حين أن جميع أجهزة الأوعية الدموية المختبرة تحفز على زيادة تنشيط نظام التخثر ومكون الإطراء. الحلقات البلاستيكية المغلفة الهيبارين يحمل اتجاها لانخفاض مستويات كلا النوعين من التنشيط مقارنة البوليمر المغلفة، حلقات PVC. حلقات اللاتكس يحمل أعلى المستويات من TNF IL-6 و PMN elastase، وتسليط الضوء على تفعيل قوية من الكريات البيض من قبل اللاتكس.

CD41 الصفائح الدموية الإيجابية تعافى من أنابيب اللاتكس، يحمل كثافة فلورية متوسطة عالية للغاية لD62P، في حين يتم تقليل التعبير المتكامل بشكل كبير على الحبيبات الحبيبية واللمفاوية. من الفائدة، ومستويات متكاملة هي أعلى في أحاديات من أنابيب اللاتكس، مما يشير إلى تفاعلات الصفائح الدموية أحادية تنشيط. في الواقع تلطيخ لتراكمات الصفائح الدموية أحادية الكيس يكشف عن زيادة الميل لتجميع في الحلقات اللاتكس والدعامات.

على الرغم من انخفاض وتيرة أحاديات داخل الحلقات اللاتكس. لتجنب تفعيل عنصر الدم الجوهري من المهم ضمان إغلاق حلقة مناسبة والتعامل مع الدم بعناية. لذلك بعد هذا الإجراء، فمن الممكن لتحليل التفاعل بين البروتينات اللينجينية أو تروكك ومكونات الدم التي تستخدم في الالتهاب أو البحوث الصيدلانية.