خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي-seq
May 28th, 2021
الغرض من هذا البروتوكول هو التحقيق في تطور والتعبير عن الجينات المرشحة باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي.
يحدد هذا البروتوكول الخطوات المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير عن الجينات المرشحة. هنا نقدم تعليمات شاملة بحيث يمكن لأي شخص لديه خبرة المعلوماتية الحيوية الحد الأدنى من تشغيل من خلال هذا البروتوكول. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا على أي كائن حي وأي عائلة جينية.
إحدى القضايا الشائعة عند القيام المعلوماتية الحيوية هي فشل البرامج النصية قذيفة. عند محاولة هذا البروتوكول، تأكد من أن لديك أحدث البرامج، اقرأ ملفات الخطأ، وتحقق من الدليل بعناية. للبدء، قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام المجموعة الكمبيوتر على محطة طرفية أو إطار تطبيق PuTTY.
على المحطة الطرفية، قم بتنزيل الإصدار 2.8.1 من مجموعة أدوات SRA باستخدام Wget، ثم قم بإنهاء تثبيت البرنامج. ابحث NCBI عن رقم الانضمام SRA للعينات المطلوبة، ثم الحصول على بيانات تسلسل RNA في إطار المحطة الطرفية. الحصول على ملفين FASTQ لنوع الملفات المقترنة نهاية.
العثور على الجينوم المرجعي على الانترنت إذا كان أحد موجود. للحصول على تجميع مرجع اكتب wget في إطار المحطة الطرفية ثم لصق عنوان الارتباط. إذا كان متوفرا، أيضا نسخ ملف GTF والبروتين FASTA ملف للجينوم المرجعي.
فهرسة الجينوم، ثم خريطة يقرأ وحساب التعبير لكل عينة. إعادة تسمية ملف النتائج إلى شيء وصفي، وإنشاء مصفوفة من جميع التهم. افتح نافذة متصفح الإنترنت واذهب إلى NCBI GenBank.
في شريط البحث، اكتب اسم جين الاهتمام واسم الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تم تسلسلها. على يسار شريط البحث، حدد Protein ( Protein)، ثم انقر فوق بحث. استخراج التسلسلات بالنقر فوق إرسال إلى ثم حدد ملف.
ضمن تنسيق ، حدد FASTA، ثم انقر فوق إنشاء ملف. نقل FASTA ملف من المتجانسات إلى كتلة الكمبيوتر باستخدام إطار محطة طرفية محلية أو FileZilla. بعد ذلك ، ابحث عن الجينات المرشحة باستخدام BLAST + على مجموعة الكمبيوتر ، قم بإجراء قاعدة بيانات BLAST من الجينوم أو البروتين المترجم بالنص ، FASTA.
BLAST تسلسل الجينات متجانسة من NCBI إلى قاعدة بيانات الأنواع ذات الاهتمام، ثم عرض ملف الإخراج باستخدام الأمر أكثر من ذلك. نسخ معرفات جينية فريدة من نوع الاهتمام إلى ملف نصي جديد. استخراج تسلسل الجينات المرشحة.
لتأكيد التعليقات التوضيحية الجينية باستخدام التبادل BLAST، انتقل إلى أداة البحث عن المحاذاة المحلية BLAST، وحدد BLASTP، ثم الصق تسلسلات المرشح، وحدد قاعدة بيانات تسلسل البروتين غير المتكررة، وانقر فوق BLAST. فتح MEGA، انقر على محاذاة، ثم تحرير بناء المحاذاة، حدد إنشاء محاذاة جديدة، وانقر فوق موافق. حدد البروتين. عند فتح نافذة المحاذاة، انقر على تحرير.
انقر فوق إدراج تسلسلات من ملف، وحدد FASTA مع تسلسل البروتين من الجينات المرشحة والمتجانسات المحتملة. حدد كافة التسلسلات. العثور على رمز الذراع وتحوم فوقه.
وينبغي أن أقول تسلسل محاذاة باستخدام خوارزمية العضلات. انقر فوق رمز الذراع، ثم انقر فوق محاذاة البروتين لمحاذاة تسلسل تحرير المعلمات أو انقر فوق موافق لاستخدام المعلمات الافتراضية. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة هيدرا فولغاريس وهو اللافقاريات المياه العذبة التي تنتمي إلى Cnidaria فيلوم.
تم التحقيق في جينات أوبسين للحصول على نظرة ثاقبة في تطور العينين والكشف عن الضوء في الحيوانات. تم استخراج تسلسل الجينات المرتبطة opsin من H.vulgaris والأنواع الأخرى في ملف FASTA من بنك NCBI GenBank. تم محاذاة جينات الأوبسين في MEGA ، مما يجعل من الممكن تحديد هيدرا أوبسين التي كانت تفتقد حمض أميني محفوظ لليسين ضروري لربط جزيء حساس للضوء.
تم إنشاء شجرة أقصى احتمال باستخدام تسلسل opsin من هيدرا vulgaris والأنواع الأخرى. يشير الفيلوجيني إلى أن جينات الأوبسين تتطور من خلال الازدواجية الخاصة بالنسب في cnidarians ، وربما عن طريق الازدواجية جنبا إلى جنب في H.vulgaris. بعد ذلك ، تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي في edgeR للتحقيق في التعبير المطلق عن جينات الأوبسين.
لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من opsins هي ما يصل تنظيمها في hypostome ، أو الرأس ، ومقارنات الزوج الحكيم من hypostome مقابل عمود الجسم ، في مهدها المنطقة والقدم ، وأجريت مخالب. وتبين أن 774 1 نسخة تم التعبير عنها بشكل متفاوت بين الهيبوستوم وعمود الجسم. تم تحديد الجينات التي تم تنظيمها عبر مقارنات متعددة ، وتم إجراء إثراء وظيفي في Blast2GO.
وأخيرا، تم التحقيق في التعبير المطلق عن جينات الأوبسين في أنسجة مختلفة خلال مراحل مختلفة من الناشئة، وخلال نقاط زمنية مختلفة من التجديد. الفحص البصري للمحاذاة والشجرة سيؤكد ما إذا كانت الجينات المرشحة تنتمي إلى عائلة الاهتمام. الجينات التي تختلف كثيرا في التسلسل أو مجموعة خارج كل شيء آخر، وربما هي جزء من عائلة الجينات المختلفة.
يمكن اعتبار نتائج هذا البروتوكول مولدة للفرضية. يمكن لخط الأنابيب هذا تسليط الضوء على الجينات المرشحة للدراسة وظيفيا في الدراسات المستقبلية. بعد استكشاف تعبير هيدرا أوبسين، نستخدم الآن تقنيات مماثلة للتحقيق في الجينات ذات الصلة عبر الأنواع من أجل تحديد أوجه التشابه والاختلاف في الوظيفة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يدرس هذا البروتوكول التطور الجزيئي والتعبير عن الجينات المرشحة باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي، مع التركيز تحديدًا على جينات الأوبسين في هايدرا فولغاريس. يعرض الدراسة خط أنابيب حيوي يمكن تطبيقه على كائنات حية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- تحليل التعبير الجيني
- التطور الجزيئي
- المعلوماتية الحيوية
الخلفية
- يدرس الجينات المرشحة ذات الصلة بالكشف عن الضوء وتطور العين
- يستخدم كائن هايدرا فولغاريس اللافقسي
- يستعين بموارد NCBI لاسترجاع بيانات التسلسل
الطرق المستخدمة
- خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتسلسل الحمض النووي الريبي
- هايدرا فولغاريس كنظام بيولوجي
- أدوات مثل BLAST و MEGA و edgeR للتحليل
النتائج الرئيسية
- تم تحديد جينات الأوبسين التي تتطور من خلال تكرارات محددة للنسالة في القردة الشعاعية
- وجدت تعبيرًا تفاضليًا لـ 1,774 نسخة نصية في أجزاء مختلفة من الجسم
- تم إنشاء شجرة تطورية بأقصى احتمال لتسلسلات الأوبسين
الاستنتاجات
- يسلط البروتوكول الضوء على إمكانات الجينات المرشحة للدراسات الوظيفية المستقبلية
- يعزز فهمنا للتطور الجيني والتعبير في العلاقة مع علم الأحياء الحسية
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This bioinformatics pipeline enables systematic investigation of gene family evolution and expression, supporting target validation through mechanistic de-risking in early discovery. By integrating phylogenetic analysis with RNA-seq quantification, it provides predictive confidence for prioritizing candidate genes with conserved or divergent functions across species. The approach aids portfolio triage by identifying mechanistically informed hypotheses before committing resources to functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying gene orthology and evolutionary relationships within target families.
- Operational Value: Enables functional target validation through comparative expression profiling across tissues and developmental stages.
- Predictive Value: Supports lead identification by highlighting genes with lineage-specific expansions and tissue-enriched expression patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated gene sets for downstream screening by confirming family membership through sequence alignment and tree topology.
- Operational Value: Generates standardized count matrices from RNA-seq data, enabling reproducible quantitative outputs for assay readiness.
- Scalability: Facilitates platform reuse across organisms by applying consistent BLAST, alignment, and phylogenetic workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase expression data to preclinical models by identifying conserved expression patterns in relevant tissues.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker discovery through differential expression analysis across conditions, such as hypostome versus body column in Hydra.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing expression dynamics during regeneration and budding stages, indicating functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling hypothesis-driven progression from sequence analysis to functional prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by generating phylogenies that reveal duplication events and selection pressures on gene families of interest.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems through normalized expression matrices that allow cross-sample comparison of gene activity.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via edgeR-based differential expression, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying genes with conserved roles in sensory systems across metazoans.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable bioinformatic capability for interrogating any gene family, reducing redundant pipeline development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through evolutionary and expression context.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via documented, stepwise bioinformatic procedures applicable across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets before investment in wet-lab validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting genes with strong evolutionary conservation and tissue-specific induction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics, including command-line tools, sequence databases, and phylogenetic software.
- Depends on access to computational infrastructure for handling large RNA-seq datasets and running BLAST, MEGA, and edgeR analyses.
- Necessitates cross-team standardization on file naming, reference genome versions, and parameter settings for alignment and tree building.
- Involves adaptation considerations when applying the pipeline to non-model organisms with incomplete genomes or annotations.
- Limited by the quality and completeness of input data, including RNA-seq depth and reference genome annotation accuracy.
