الكشف الجيني المتغير في الجين CALR باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة

تحدد هذه الطريقة بدقة طفرات الكالريتيكولين في المرضى الذين يشتبه في إصابتهم بأمراض الدم ، خاصة عندما تكون خيارات التشخيص الأخرى محدودة أو يكون هناك تداخل مع الحالات غير الدموية. تتمثل الميزة الرئيسية لتقنية المرآة عالية الدقة في اكتشاف المتغيرات الجينية الجسدية الشائعة في منطقة النقطة الساخنة لجين الكالريتيكولين بالحد المقبول للكشف والتكلفة المعقولة. تتيح هذه التقنية التشخيص السريع وغير الجراحي لاضطرابات التكاثر النقوي ، وخاصة كثرة الصفيحات الأساسية والتليف النقوي الأولي.

حاليا ليس له أي تأثير على اختيار العلاج لدى هؤلاء المرضى. ومع ذلك ، قد يتغير هذا في المستقبل. ابدأ بإعداد مزيج qPCR HRM الرئيسي كما هو موضح في المخطوطة النصية ، مما يجعل ما يكفي لثلاث نسخ مكررة من كل عينة من الحمض النووي والتحكم.

امزج محتويات التفاعل عن طريق النقر برفق على الأنبوب وعكسه والدوامة لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان، ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لتجميع القطرات المتناثرة. انقل 19 ميكرولترا من المزيج الرئيسي qPCR HRM إلى كل بئر من لوحة التفاعل البصري 96 Well. ماصة ميكرولتر واحد من الضوابط السلبية والضوابط الإيجابية والعينات في الآبار المناسبة للوحة للتحكم في عدم وجود قالب أو NTC في ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المعقم والمياه الحرة للحمض النووي المستخدمة لتحضير المزيج الرئيسي qPCR HRM بدلا من الحمض النووي.

أغلق لوحة التفاعل بإحكام بغشاء لاصق بصري لمنع التبخر أثناء التشغيل. ثم قم بتدويرها عند 780 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. تأكد من أن السائل في قاع الآبار في لوحة التفاعل وقم بإجراء الفحص.

قم بتعيين عناصر التحكم والعينات للآبار المناسبة في برنامج نظام الأجهزة وقم بتغيير بروتوكول تضخيم الجهاز الافتراضي. قم ببرمجة الأداة كما هو موضح في المخطوطة النصية لإجراء تحليل التفكك مباشرة بعد qPCR. عند انتهاء تشغيل المراجعة والتحقق من مخطط التضخيم.

في قائمة التجربة الخاصة ببرنامج نظام الأداة ، حدد خيار مخطط التضخيم. إذا لم يتم عرض أي بيانات، فانقر فوق الزر تحليل الأخضر. في علامة التبويب مخطط التضخيم من القائمة المنسدلة نوع المؤامرة ، حدد المخطط الذي يعرض بيانات التضخيم كقراءات التألق ، تمت تسويته إلى التألق من المرجع السلبي كدالة لرقم الدورة ، في القائمة المنسدلة لون المؤامرة ، حدد عينة.

من القائمة المنسدلة نوع الرسم البياني، حدد نوع الرسم البياني للتضخيم الخطي، وتحقق من تعيين دورة بدء ونهاية الخط الأساسي بشكل صحيح. يجب ضبط الدورة النهائية قبل بضع دورات من رقم الدورة حيث يتم الكشف عن إشارة فلورية كبيرة. من القائمة المنسدلة نوع الرسم البياني ، حدد نوع الرسم البياني للتضخيم للسجل 10 يظهر خط العتبة على الرسم البياني عن طريق تحديد خيار الحد وضبط الحد.

يجب أن يعبر خط العتبة المرحلة الأسية عند منحنيات qPCR. تحقق من أن جميع آبار العينات والتحكم الإيجابي لها منحنيات تضخيم عادية وأنه لا يوجد تضخيم في آبار NTC. تظهر مخطط التضخيم العادي زيادة هائلة في الإزهار تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35.

في منحنيات الذوبان المشتقة ، راجع مناطق ما قبل وبعد الذوبان أو خطوط درجة الحرارة. يجب أن تكون مناطق ما قبل وبعد الذوبان داخل منطقة مسطحة حيث لا توجد قمم أو منحدرات كبيرة في مستويات الفلورسنت. إذا لزم الأمر ، قم بتعيين بداية وإيقاف خطوط درجة حرارة ما قبل وبعد الذوبان ، بمسافة 0.5 درجة مئوية تقريبا عن بعضها البعض.

أعد تشغيل التحليل إذا تم ضبط المعلمات بالنقر فوق زر التحليل. في علامة تبويب إعدادات المؤامرة في علامة تبويب وعاء الفرق ، اختر أحد عناصر التحكم في النوع البري المتكررة كDNA المرجعي وأعد تشغيل التحليل بالنقر فوق زر التحليل. في علامة التبويب منحنيات الذوبان المحاذاة ، تأكد من أن جميع عناصر التحكم الإيجابية لها النمط الجيني الصحيح وأن NTC فشل في التضخيم.

من جدول البئر ، حدد بئر تحكم لتسليط الضوء على منحنى الذوبان المقابل في مخططات التحليل والتأكد من أن لون الخط يتوافق مع النمط الجيني الصحيح. في علامة التبويب منحنيات الذوبان المحاذاة ، راجع بعناية عروض المؤامرة للعينات غير المعروفة وقارنها بشاشات عرض المؤامرة لعناصر التحكم. حدد الآبار التي تحتوي على عينة غير معروفة تتكرر وقم بمحاذاة منحنيات الذوبان مع عناصر التحكم في تسلسل مرتب عن طريق تحديد الآبار التي تحتوي على أدوات التحكم واحدة تلو الأخرى.

قم بتحليل نتيجة العينة غير المعروفة في علامة التبويب مخطط الفرق للتحقق من اتساق النتائج التي تم الحصول عليها. حدد الآبار التي تحتوي على عينة غير معروفة مكررة وقم بمحاذاة منحنيات الذوبان مع عناصر التحكم في تسلسل مرتب ، وحدد الآبار التي تحتوي على عناصر تحكم واحدة تلو الأخرى. قم بتشغيل منتجات qPCR HRM على جل أجروز مسبقة الصب بنسبة 4٪ يحتوي على سلالة من الحمض النووي الفلوري.

قم بتشغيل NTC سلبي واحد فقط وعينة من النسخ المتماثلة qPCR HRM. قم بإزالة الجل الجاهز والكاسيت من العبوة ثم قم بإزالة المشط وأدخل الجل في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتخفيف عينة سعة 10 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر بماء خال من الحمض النووي الريبي والحمض النووي المعقم وقم بتحميل كل بئر ب 20 ميكرولتر من العينة المخففة.

قم بتخفيف ثلاثة ميكرولترات من المحلول القياسي بحجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر وتحميله في بئر العلامة. املأ أي آبار فارغة ب 20 ميكرولترا من الحمض النووي الريبي المعقم والمياه الحرة للحمض النووي. حدد البرنامج على الفور وفقا للنسبة المئوية للهلام الذي يتم تشغيله واضبط وقت التشغيل على الجهاز على 20 دقيقة.

ابدأ الرحلان الكهربائي في غضون دقيقة واحدة من تحميل العينات. عند اكتمال الرحلان الكهربائي ، تصور الحمض النووي والهلام باستخدام الضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية. وتضخيم منطقة الحمض النووي ذات الأهمية بنجاح مع زيادة أسية في الفلورسنت تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35 والقيم الضيقة جدا لدورة القياس الكمي في جميع التكرارات والضوابط هي شرط أساسي لتحديد موثوق للتباين الجيني عن طريق تحليل الذوبان عالي الدقة.

يتم إجراء تحليل إدارة الموارد البشرية مباشرة بعد qPCR ، ويتم استخدام مناطق الذوبان النشطة للعينات ، وأدوات التحكم و NTC لإنشاء مخططات منحنى الذوبان المحاذاة الخاصة بها. تعد مناطق ما قبل وبعد الذوبان المحددة بشكل صحيح مهمة لتصور وتحديد التباين الجيني في العينات بشكل صحيح. يتم عرض منحنيات الذوبان المحاذاة والأواني المختلفة هنا.

محاذاة العينات غير المعروفة بإحكام مع أحد عناصر التحكم الإيجابية. تؤدي المناطق أو خطوط درجة الحرارة المضبوطة بشكل غير صحيح قبل وبعد الذوبان إلى منحنيات ذوبان محاذاة ومخططات مختلفة حيث يكون التحديد الصحيح للتباين الجيني أكثر صعوبة. يمكن تحديد المتغير الجيني في العينة من خلال مقارنة نمط النطاق للعينة بعناصر التحكم.

ومن خلال الجمع بين HRM والرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. لا يمكن إجراء التحديد الصحيح للمتغير الجيني إلا للعينات التي تحتوي على نفس المتغير الجيني مثل أحد الضوابط المستخدمة في مقايسة إدارة الموارد البشرية. تختلف العينات التي تحتوي على متغيرات جينية نادرة في الكالريتيكولين في نتيجة إدارة الموارد البشرية ونمط نطاق الرحلان الكهربائي.

عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم مقارنة عروض مخطط منحنى الذوبان المحاذاة بعناية للعينات المعروفة وعينات التحكم.