Name: إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: تعلم تقنية حقن أجنة بعوض Culex pipiens باستخدام CRISPR/Cas9 لإنشاء طفرات فارغة. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة وظائف الجينات في ناقلات الأمراض.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتور ديفيد أوبروشتا وجميع أعضاء شبكة أبحاث تنسيق التقنيات الوراثية الحشرية على المساعدة والتدريب الذي يقدمونه لنا وللآخرين على تنفيذ التقنيات الوراثية. نشكر بشكل خاص تشانا الوفيهاري لتحسين بروتوكول الضخ الدقيق للسماح بحقن أجنة Culex وتفقيسها. كما نشكر ديفانتي سيمونز وجوزيف أورسو، الطلاب الجامعيين العاملين في مختبر ميوتي، على مساعدتهم في رعاية وفحص البعوض المعدل وراثيا، وزورا إلمكامي من ال ITF للمساعدة في تربية البعوض وإعداده للحقن. وقد دعم هذا العمل منحة متعددة التخصصات من معهد الأمراض المعدية في جامعة ولاية أوسو قدمت إلى وزارة الميكنة.

<ol><li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li>
<li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li>
<li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li>
<li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li>
<li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li>
<li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Entomological+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li>
<li>Eldridge, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+photoperiod+on+blood-feeding+and+ovarian+development+in+mosquitoes+of+the+Culex+pipiens+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).</li>
<li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li>
<li>Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+host+preferences+of+above-and+below-ground+Culex+pipiens+mosquitoes+and+their+hybrid+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring.</a> Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).</li>
<li>Meola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+and+humidity+on+embryonic+longevity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti.</a> Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).</li>
<li>Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+efficient+genomic+editing+system+with+CRISPR%2FCas9+in+the+vector+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus.</a> Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).</li>
<li>Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+causality+between+CYP9M10+and+pyrethroid+resistance+using+the+TALEN+and+CRISPR%2FCas9+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies.</a> Scientific Reports. 6, 24652(2016).</li>
<li>Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).</li>
<li>Anderson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+the+West+Nile+Virus+vector%2C+Culex+quinquefasciatus+Say%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say.</a> PloS one. 14 (11), (2019).</li>
<li>Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).</li>
<li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li>
<li>Monnerat, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+albitarsis+embryogenesis%3A+morphological+identification+of+major+events%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li>
<li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
</ol>

يعمل RH في مرفق تحويل الحشرات ، الذي يقدم خدمات في التعديل الوراثي للحشرات.

يقدم هذا البروتوكول طرقا لإدخال طفرات محددة في جينوم بعوض Culex ويمكن استخدامه لتحرير جينوم البعوض الآخر أيضا. البروتوكول مهم من حيث أنه يوفر تفاصيل محددة ليس فقط عن كيفية إعداد مواد الحقن ، ولكن أيضا لمحة عامة مفصلة عن كيفية حث البعوض على وضع البيض ، وكذلك كيفية إعداد وحقن تلك البيضات. كما نلخص كيفية الاستفادة من بيولوجيا الإناث Cx. pipiens لوضع البيض في الطوافات الفردية وبالتالي فحص نسبة أصغر من النسل من كل أنثى للطفرات المطلوبة. تم تحسين الأساليب المعروضة هنا ل Cx. pipiens ولكن يمكن تكييفها ...

يتم توزيع البعوض Culex في جميع أنحاء المناطق المعتدلة والاستوائية في العالم وينقل العديد من الفيروسات القاتلة بما في ذلك فيروس غرب النيل1، التهاب الدماغ سانت لويس2 وكذلك الديدان الخيطية التي تسبب دودة القلب ال3 وداءالفيلة 4. أعضاء مجمع Culex pipiens ، الذي يتضمن Cx. quinquefasciatus، Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus، يظهرون اختلافات مذهلة في العديد من جوانب بيولوجيتهم. على سبيل المثال، في حين Cx. quinquefasciatus وCx. pipiens molestus غير قادرين على دخول نائمة overwintering5،6، Cx. pipiens pipiens عرض استجابات موسمية قوية وأدخل diapause ردا على أيام قصيرة7،8. بالإضافة إلى ذلك ، Cx. pipiens molestus تميل إلى أن تكون أكثر أنثروبوفيليا في حين Cx. pipiens و Cx. quinquefasciatus هي أكثرzoophilic 6. ومع ذلك ، في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العديد من الأماكن الأخرى في العالم ، تهجين هذه الأنواع ، مما له آثار قوية على انتقال المرض كهجينات من Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus هي مغذيات انتهازية وستعض كل من الطيور والبشر9، وبالتالي تعمل كناقلات جسر لفيروس غرب النيل. وقد تعرقلت دراسة هذه الجوانب وغيرها من الجوانب الرائعة لبيولوجيا البعوض Culex ، ويرجع ذلك جزئيا ، لأن البعوض Culex هي أكثر صعوبة قليلا لتربية في المختبر من البعوض الزاعجة ، والتي تنتج البيض هادئة ومقاومة للجفاف10 ولأن الأدوات الجزيئية الوظيفية ليست متطورة بشكل جيد لأنواع Culex. 
CRISPR/Cas9 تحرير الجينوم هو التكنولوجيا القوية التي تم استخدامها لتقييم بيولوجيا العديد من أنواع البعوض الهامة11،12،13، بما في ذلك البعوض البيت الجنوبي ، Culex quinquefasciatus14،15،16. هذه التكنولوجيا، التي وضعتها جنيفر دودنا وإيمانويل شاربنتييه، يستغل الدفاع البكتيري الطبيعي ضد الفيروسات عن طريق المشتقة من البكتيريا، وEDONUCLEASES كريسبر المرتبطة (بروتينات كاس؛ انظر الاستعراض من قبل فان دير أوستوآخرون. 17). عند حقنها في الأجنة الحيوانية، يمكن للبروتينات Cas9 بالاشتراك مع الحمض النووي الريبي دليل مناسب تنتج فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل داخل الجينوم. ويتم ذلك في أغلب الأحيان باستخدام بروتين Cas9 المعقد مع الرناس الإرشادي ، الذي يوجه نشاط الإندونوكليا إلى منطقة محددة من الجينوم. بعد أن خلق البروتين Cas9 كسر مزدوجة تقطعت بهم السبل موقع محدد، والآلات الخلوية محاولات لإصلاح كسر باستخدام واحدة من آليتين. الأول ينطوي على ربط الطرفين معا من خلال الانضمام إلى نهاية غير متجانسة (NHEJ) ، وهو عرضة للخطأ وغالبا ما تنتج عمليات الإدراج والحذف خارج الإطار في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى بروتينات غير وظيفية ، وبالتالي توليد طفرة خروج المغلوب. بدلا من ذلك، قد تستخدم الآلات الخلوية إصلاح موجهة بالأوهام (HDR) عن طريق العثور على تسلسل مماثل لإصلاح الفاصل بشكل صحيح. ويمكن توفير تسلسل مماثل من الكروموسوم الثاني داخل الكائن الحي (انظر الاستعراض18). ومع ذلك ، إذا كان التسلسل الذي تم إصلاحه يطابق التسلسل الأصلي تماما ، فسيتمكن بروتين Cas9 من قطع الحمض النووي مرة أخرى. وبدلا من ذلك، يمكن للباحثين أيضا تضمين بلازميد متبرع يحتوي على تسلسلات متجانسة على جانبي موقع القطع للتسلسل المستهدف مع تسلسل إصلاح بديل - غالبا ما يكون بروتين علامة فلورية، أو نسخة معدلة من الجين الأصلي، أو أي تعديل آخر - يمكن نسخه وإدخاله في الجينوم، أو "طرقه".
التوقيت أمر بالغ الأهمية عند حقن الأجنة ، وهذا هو الحال بشكل خاص عند استخدام تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 لإنشاء طفرات في الحشرات. وذلك لأن بروتين Cas9 وgRNAs لديهما القدرة الأكبر على توليد الطفرات فقط عندما يكون الجنين في حالته المتزامنة ، قبل أن تتشكل الأغشية الخلوية وعندما يمكن الوصول إلى نواة متعددة داخل الجنين. للبعوض ، تصل النوى إلى المحيط بعد ~ 2-4 ساعات من التكاثر ، اعتمادا على درجة الحرارة19، وبالتالي يجب أن يحدث تحري دقيق ناجح قبل هذا الوقت. بالإضافة إلى ذلك، فإن البروتين Cas9 قطع أي الحمض النووي التي يمكن الوصول إليها، بحيث الفرد الناتج عن الحقن سوف تحتوي على فسيفساء من الخلايا، وبعضها لديه الطفرة المطلوبة، والبعض الآخر لا. من أجل أن تكون هذه الطفرات موروثة بنجاح، يجب على بروتين Cas9 قطع الحمض النووي الذي يوجد في الجرثومة التي من شأنها أن تؤدي إلى البويضات والحيوانات المنوية في المستقبل. لضمان أن يتم إنشاء الطفرات في الجرثومة فمن الأفضل لحقن جميع المواد القريبة من موقع خلايا القطب داخل الجنين ، والتي هي السلف من الجرثومة الحشرية. وتقع خلايا القطب بالقرب من النهاية الخلفية للأجنة Culex 20. بالإضافة إلى حقن الأجنة، من الضروري وضع خطة دقيقة لعبور وفحص النسل من أجل الكشف عن الطفرة المرجوة.
يصف هذا البروتوكول كيفية توليد gRNAs وتعقيدها مع بروتين Cas9 لإعداد خلطات الحقن ، وكذلك كيفية حث البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض وكيفية إعداد وحقن تلك البيض لتحرير الجينوم بوساطة CRISPR/Cas9. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بوصف كيفية تربية الأجنة المحقونة وذرية الصليب وفحصها لتأكيد أنه تم الحصول على الطفرة المطلوبة. باستخدام هذا البروتوكول، قمنا بتوليد الطفرات فارغة لجين من الاهتمام، دورة،في سلالة باكاي من Culex pipiens. تأسست هذه السلالة في الأصل في عام 2013 من البعوض الذي تم جمعه ميدانيا في كولومبوس، أوهايو، ويحتفظ بها مختبر ميوتي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء دراسات إضافية تتطلب تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 في بعوض Culex ، وكذلك أنواع البعوض الأخرى ، وبشكل أعم ، وثيق الصلة بتوظيف تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 لأي نوع من أنواع الحشرات.

<table><tbody><tr><td>مغذي الأغشية الاصطناعية</td><td>Hemotek</td><td>SP5W1-3</td><td>موقع الشركة: بلاكبيرن ، المملكة المتحدة</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td>موقع الشركة: كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>أنابيب البورسليكات الزجاجية الشعرية ، القطر الخارجي 1 مم</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-6</td><td>موقع الشركة: ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>BV10 إبرة شطف</td> أدوات <td>SUTTER</td><td>BV-10-B</td><td>موقع الشركة: نوباتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr> ورق <tr><td>ترشيح دائري Whatman (12.5 سم)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td>موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>أنبوب مخروطي (50 مل)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 339652</td><td>موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>ورق ترشيح دورة Fisherbrand بمعدل تدفق سريع</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-800</td><td>موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>غطاء زجاجي (24 × 40 مم)</td><td>ثيرمو فيشر ساینتفيك</td><td>50-311-20</td><td>موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>سد الأسنان</td><td>Henry Schein</td><td>Inc 1010171</td><td>موقع الشركة: ميلفيل ، نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>سكوتش شريط على الوجهين</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td>موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i الحاقن الدقيق</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>موقع الشركةهامبورغ ، ألمانيا</td></tr><tr><td>قارورة زجاجية (2 درام)</td><td>ثيرمو فيشر ساينتفيك</td><td>033401C</td><td>موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>زيت الهالوكربون</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H8898-50ML</td><td>موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>P-2000 ليزر إبرة مجتذب</td><td>أدوات Sutter</td><td>P-2000 / G</td><td>موقع الشركة: نوباتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>بارافيلم</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>50-998-944</td><td>موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>PC-100 مجتذب إبرة مرجح</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>هذا متوافق مع طراز PC-10 السابق ، والذي تم إيقافه. موقع الشركة: أميتيفيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>فير دايركت PCR Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F140WH</td><td>موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>Kodak Photo-Flo (1٪)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-268-05</td><td>موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة</td></tr><tr><td>الأمريكية أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية الكوارتز ، 1 مم القطر الخارجي</td><td>Capillary Tube Supplies Limited</td><td>QGCT 1.0</td><td>موقع الشركة: كورنوال ، المملكة المتحدة</td></tr><tr><td>دليلها & تجارة; مجموعة فحص sgRNA</td><td>تاكارا ، بيو يو 632639</td><td></td><td>تتيح لك هذه المجموعة تحديد ما إذا كانت الحمض النووي الريبي يقطع تسلسل الحمض النووي في المختبر. موقع الشركة: ماونتن فيو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>سيجماكوت</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>SL2-100ML</td><td>موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>أطباق بتري صغيرة (35 × 10 مم)</td><td>ثيرمو فيشر ساینتفيك</td><td>50-190-0273</td><td>موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>سترات الصوديوم دم الدجاج</td><td>لامبير البيولوجية</td><td>7201406</td><td>موقع الشركة: إيفريت ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>طبق بتري فيشربراند سكوير (10 سم × 10 سم)</td> موقع <td>شركة Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>Henry Schein Inc.</td><td>7771180</td><td>موقع الشركة: ميلفيل ، نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>طعام الأسماك الاستوائية</td><td>Tetramin</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Whatman ورق ترشيح</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-927-826</td><td>موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>ورق ترشيح Whatman ، 4.25 سم</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1001-042</td><td>موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr></tbody></table>

إعداد وحقن أجنة البعوض culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام crispr / cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

البعوض Culex هي النواقل الرئيسية للعديد من الأمراض التي تؤثر سلبا على صحة الإنسان والحيوان بما في ذلك فيروس غرب النيل والأمراض الناجمة عن الديدان الخيطية مثل دودة القلب الناب وداء الفيلة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 للحث على الطفرات الموجهة إلى الموقع عن طريق حقن بروتين Cas9 الذي تم تعقيده مع الحمض النووي الريبي (gRNA) في الأجنة الطازجة من عدة أنواع من الحشرات ، بما في ذلك البعوض الذي ينتمي إلى جنس Anopheles و Aedes. إن التلاعب بعوض Culex وحقنه أكثر صعوبة قليلا لأن هذه البعوض تضع بيضها منتصبا في الطوافات بدلا من وضعها بشكل فردي مثل الأنواع الأخرى من البعوض. هنا نصف كيفية تصميم الحمض النووي الريبي ، وتعقيدها مع بروتين Cas9 ، وحمل البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض ، وكيفية إعداد وحقن الأجنة الموضوعة حديثا للتشخيص الدقيق مع Cas9 / gRNA. كما نقوم بوصف كيفية إعادة فحص البعوض المحقون وفحصه للكشف عن الطفرة المرغوبة. وتبين النتائج التمثيلية أن هذه التقنية يمكن استخدامها للحث على حدوث طفرات موجهة نحو الموقع في جينوم بعوض كوليكس، ويمكن استخدامها، مع تعديلات طفيفة، لتوليد طفرات فارغة في أنواع البعوض الأخرى أيضا.

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تمكنا من حقن أجنة Cx. pipiensبنجاح ، ولاحظنا معدلا مرتفعا للبقاء على قيد الحياة بين الأجنة المحقونة (~ 55 ٪ ، الشكل 1). كانت نسبة البقاء على قيد الحياة في التجارب السابقة أقل، على الأرجح لأن الجزء الأمامي من بصيلات البيض كان متصلا بشريط التضميد الطبي، مما منع يرقات البعوض من الهروب من المشيمة والسباحة بنجاح في الماء. ضمان أن تمتد النهاية الأمامية إلى ما وراء قطاع الضمادات الطبية زاد بشكل كبير من بقاء اليرقات ، ويؤدي إلى ذرية عالية الجودة قادرة على التطو...

يستخدم CRISPR/Cas9 بشكل متزايد لتوصيف وظيفة الجينات في الكائنات غير النموذجية. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد خطوط خروج المغلوب من Culex pipiens، من إعداد خلطات الحقن ، إلى الحصول على أجنة البعوض وحقنها ، وكذلك كيفية تربية البعوض المحقون وعبوره وفحصه وذريه للطفرات المطلوبة.

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر إرشادات مفصلة حول كيفية تحضير وأجنة البعوض لحقنها لتحرير جينوم CRISPR-Cas9. تتمثل المزايا الرئيسية لتقنية الحقن الدقيق هذه في أنها تحتوي على معدل مرتفع من بقاء البعوض على قيد الحياة ، وتسمح للباحثين بتحديد وظيفة الجين. تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا لحقن البعوض الذي ينتمي إلى جنس Culex.ينقل هذا البعوض العديد من مسببات الأمراض ، بما في ذلك الفيروسات التي تسبب حمى غرب النيل والتهاب الدماغ في سانت لويس وكذلك الديدان الخيطية الخيطية التي تسبب الدودة القلبية للكلاب وداء. لذلك ، فإن وجود أدوات مثل تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 ، سيسمح لنا بفهم هذه العوامل المرضية المهمة والتحكم فيها بشكل أفضل. يستغرق حقن أجنة الحشرات الموضوعة حديثا ، والحصول على معدل أعلى للبقاء على قيد الحياة الكثير من الوقت والممارسة والصبر.لذلك نوصي بحقن العديد من الأجنة بمحلول ملحي ملون قبل حقن مواد باهظة الثمن لتوليد طفرة. ابدأ بإعادة ملء إبر الحقن بمزيج الحقن. اختر حشو إبرة أو طرف تحميل هلام يتناسب بسهولة مع الطرف الخلفي لإبرة الحقن المحددة.تأكد من وجود مسافة صغيرة بين نهاية حشو الإبرة وإبرة الحقن. استنشق بعناية ، قطرة صغيرة واحدة من مزيج الحقن في إبرة الحقن بالقرب من المكان الذي تبدأ فيه في الاستدقاق. ثم قم بتوصيل إبرة الحقن بالحاقن الصغير.ضع الشريحة التي تحتوي على الأجنة على مسرح المجهر. لفتح الإبرة ، استخدم ضغط حقن بدء يبلغ حوالي 30 رطل لكل بوصة مربعة واضبطه حسب الضرورة لتقديم حجم مناسب من مزيج الحقن. تحت مجهر التشريح ، ضع الإبرة فوق جنين البعوض ، واستخدم بعناية أداة المعالجة الدقيقة لخفض الإبرة على الجنين.بمجرد أن تلمس الإبرة الجنين بالكاد ، حرك الجنين بسرعة بشكل عمودي على المحور الطويل للإبرة. لتحديد ما إذا كانت الإبرة قد تم فتحها بنجاح ، اضغط على مشغل الحقن ومعرفة ما إذا كانت أي فقاعات أو مزيج حقن يهرب من الإبرة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر تحريك جنين البعوض ضد الإبرة حتى يتم فتحها ويهرب مزيج الحقن عند الضغط على الزناد.ضع أول جنين بعوض في وسط الرؤية ، وتأكد من أنه في بؤرة التركيز وضع الإبرة فوق البويضة الأولى. قم بزيادة التكبير تدريجيا على المجهر ، وخفض الإبرة بعناية لإبقائها فوق الجنين الأول مباشرة. استمر حتى يصل المجهر إلى أعلى تكبير له ، ويكون كل من الجنين والإبرة في بؤرة التركيز.حرك الجنين قليلا إلى اليسار وخفض الإبرة بحيث تكون في نفس مستوى رؤية الجنين. استخدم مرحلة المجهر للمس الجنين برفق على طرف الإبرة. يجب أن ينحرف الطرف الخلفي الضيق لجنين البعوض قليلا.باستخدام مرحلة المجهر ، حرك الطرف الخلفي للجنين على الإبرة ولاحظ الإبرة تخترق مشيضة بيضة البعوض. يجب أن تخترق الإبرة الغشاء والموقع التقريبي للخلايا القطبية داخل الجنين. وضع مزيج الحقن في هذه المنطقة ، يزيد من احتمالية حدوث الطفرات وتوريثها في السلالة الجرثومة.اسحب زناد الحقن مرة إلى ثلاث مرات لإطلاق مزيج الحقن في الجنين. قم بتوصيل كمية صغيرة من مزيج الحقن ، بما يكفي فقط بحيث يمكن اكتشاف مقاصة صغيرة في بلازما الجنين. استخدم المرحلة لتحريك الجنين إلى اليمين والبعيد وبعيدا عن طرف الإبرة.إذا سارت الحقنة على ما يرام ، يجب أن يتسرب القليل من السوائل من الجنين. حرك المرحلة لأسفل بحيث يتم وضع الجنين التالي أمام الإبرة. وكرر الحقن.إذا لم يبد أن مزيج الحقن يخرج ، أو إذا هربت كمية كبيرة من السائل من الجنين بعد إزالة الإبرة ، فاستبدل إبرة الحقن وابدأ من جديد. تدمير أي بيض غير محقون أو تالف. بعد حقن جميع الأجنة الموجودة على الشريحة ، اغسل زيت الهالوكربون عن طريق تطبيق ماء التناضح العكسي بزجاجة بخ.قم بتوجيه تيار الماء إلى الجزء العلوي من الغطاء الزجاجي الذي ينزلق فوق الأجنة المحقونة واسمح للماء بالتدفق أسفل زلة الغطاء ، مع التأكد من عدم توجيه التيار إلى الأجنة. قم بتغطية الشريحة ب 150 ميكرولتر من الماء وضعها على ورق ترشيح مبلل داخل طبق بتري مربع. احتضان طبق بتري في غرفة بيئية ، مضبوطة على 25 إلى 27 درجة مئوية و 70 إلى 80٪ رطوبة نسبية مع فترة ضوئية طويلة اليوم.تم استخدام هذا البروتوكول لحقن أجنة بعوض المنزل الشمالي بنجاح ، Culex pipiens لضمان أن الطرف الأمامي لجنين البعوض يمتد إلى ما وراء شريط الضمادات الطبية ، مما يزيد بشكل كبير من بقاء اليرقات وينتج عنه ذرية عالية الجودة قادرة على التطور إلى مرحلة البلوغ والتكاثر. كشف التسلسل ، أن ما يقرب من 10٪ من البعوض الذي تم فحصه أظهر إدخالا أو حذفا صغيرا بالقرب من موقع قطع Cas9 للدليل الأول للحمض النووي الريبي ، مما يشير إلى أن الخلايا القطبية قد تم استهدافها بنجاح أثناء الحقن الدقيق. نجح أفراد F1 في التزاوج وإنتاج ذرية قابلة للحياة ، بعضها احتوى أيضا على الطفرة.عند حقن أجنة الحشرات الدقيقة ، يعاني معظم الناس من فتح الإبرة في البداية وتحريك الجنين إلى الإبرة. تذكر أن تطوير هذه المهارات يستغرق وقتا وممارسة. يمكن تعديل هذا البروتوكول أو تكييفه لحقن أجنة البعوض الآخر أو حتى أنواع الحشرات الأخرى.بالإضافة إلى استخدام هذا البروتوكول للتخلص من الجينات من خلال تحرير الجينوم المستهدف CRISPR-Cas9 ، يمكن استخدام نفس التقنيات لحقن البلازميدات أو الينقولات إما للجينات أو توليد طفرات عشوائية. يستخدم مختبري حاليا هذه التقنية لفهم كيفية قياس البعوض يوميا وتنظيم استجاباته الموسمية بشكل أفضل. ومع ذلك ، كيف نستخدم نحن الباحثون تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 لفهم بيولوجيا العديد من الكائنات الحية بشكل أفضل.

preparing-injecting-embryos-culex-mosquitoes-to-generate-null

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نوضح توصيل محرك الجينات في جنين بعوضة Anopheles gambiae من خلال تقنية الحقن المجهري للجنين. يسمح هذا الإجراء بدمج بنية الحمض النووي التي يتم تسليمها ، من خلال إعادة التركيب المتماثل ، في خلايا السلالة الجرثومية لتوليد مجموعات البعوض المتحولة.

الحقن المجهري لجنين البعوض: تقنية لتوصيل الحمض النووي الخارجي إلى صفار الجنين من Anopheles Gambiae لتوليد طفرات السلالة الجرثومية

هنا، نقدم طريقة معدلة للحفظ بالتبريد للأجنة ذات الخلية الواحدة، فضلا عن بروتوكول يُشبه استخدام الأجنة المذابة بالتجميد والكهربية من أجل الجيل الفعال من الفئران المعدلة وراثيا.

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

يفصل هذا البروتوكول خطوات تكوين الحشرات المستهدف CRISPR/Cas9 في ذباب الرمل: جمع الأجنة، والحقن، وتربية الحشرات، وتحديد الهوية، فضلا عن اختيار الطفرات ذات الاهتمام.

ذبابة الرمل (Phlebotomus باباتاسي) الجنين الميكروبيكشن ل CRISPR/Cas9 موتاجينيسيس

تعتمد العديد من خصائص eusociality للحشرات على التواصل داخل المستعمرة وتقسيم العمل. يوفر التلاعب الجيني للجينات التنظيمية الرئيسية في أجنة النمل عن طريق الحقن المجهري والطفرات بوساطة كريسبر نظرة ثاقبة لطبيعة السلوك الإيثاري في الحشرات الاجتماعية.

حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos

يظهر هنا بروتوكول الحقن المجهري للأجنة Helicoverpa armigera (Hübner) وتحديد الطفرات بالضربة القاضية التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. تتيح الحشرات الطافرة إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في الجسم الحي.

الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

فيما يلي بروتوكولات لجمع وحقن أجنة نطاط الذرة قبل الخلوية لغرض تعديل الجينوم الخاص بها عن طريق تحرير الجينوم القائم على CRISPR / Cas9 أو لإضافة عناصر قابلة للنقل ملحوظة من خلال تحويل الخط الجرثومي.

الحقن المجهري لنطاط الذرة ، Peregrinus maidis ، الأجنة لتحرير جينوم CRISPR / Cas9

هذه المادة تفاصيل بروتوكول لتحديد سريع من indels الناجمة عن CRISPR / Cas9 واختيار خطوط متحولة في Aedes aegypti البعوض باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة.

Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti

يعتمد التطور المبكر على المنتجات الموروثة من الأم ، ودور العديد من هذه المنتجات غير معروف حاليا. في هذا الصدد، وصفنا بروتوكولا يستخدم تقنية كريسبر-كاس9 لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في جيل واحد.

تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

هنا ، نصف تقنية بسيطة مخصصة للتوليد الفعال للفئران المعدلة وراثيا تسمى CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). توفر هذه الطريقة كواشف التحرير عن طريق التثقيب الكهربائي في الأجنة بكفاءة تقترب من 100٪. هذا البروتوكول فعال للطفرات النقطية ، والإدخالات الجينومية الصغيرة ، والحذف في أجنة الثدييات.

تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتحرير الجينوم من خلال الحقن المجهري الجنيني في البعوض A. aegypti باستخدام تقنية CRISPR-Cas9.

تحرير الجينوم في بعوض الحمى الصفراء الزاعجة المصرية باستخدام CRISPR-Cas9

تعلم تقنية حقن أجنة بعوض Culex pipiens باستخدام CRISPR/Cas9 لإنشاء طفرات فارغة. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة وظائف الجينات في ناقلات الأمراض.

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

استكشف المزيد من الفيديوهات