إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر إرشادات مفصلة حول كيفية تحضير وأجنة البعوض لحقنها لتحرير جينوم CRISPR-Cas9. تتمثل المزايا الرئيسية لتقنية الحقن الدقيق هذه في أنها تحتوي على معدل مرتفع من بقاء البعوض على قيد الحياة ، وتسمح للباحثين بتحديد وظيفة الجين. تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا لحقن البعوض الذي ينتمي إلى جنس Culex.

ينقل هذا البعوض العديد من مسببات الأمراض ، بما في ذلك الفيروسات التي تسبب حمى غرب النيل والتهاب الدماغ في سانت لويس وكذلك الديدان الخيطية الخيطية التي تسبب الدودة القلبية للكلاب وداء. لذلك ، فإن وجود أدوات مثل تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 ، سيسمح لنا بفهم هذه العوامل المرضية المهمة والتحكم فيها بشكل أفضل. يستغرق حقن أجنة الحشرات الموضوعة حديثا ، والحصول على معدل أعلى للبقاء على قيد الحياة الكثير من الوقت والممارسة والصبر.

لذلك نوصي بحقن العديد من الأجنة بمحلول ملحي ملون قبل حقن مواد باهظة الثمن لتوليد طفرة. ابدأ بإعادة ملء إبر الحقن بمزيج الحقن. اختر حشو إبرة أو طرف تحميل هلام يتناسب بسهولة مع الطرف الخلفي لإبرة الحقن المحددة.

تأكد من وجود مسافة صغيرة بين نهاية حشو الإبرة وإبرة الحقن. استنشق بعناية ، قطرة صغيرة واحدة من مزيج الحقن في إبرة الحقن بالقرب من المكان الذي تبدأ فيه في الاستدقاق. ثم قم بتوصيل إبرة الحقن بالحاقن الصغير.

ضع الشريحة التي تحتوي على الأجنة على مسرح المجهر. لفتح الإبرة ، استخدم ضغط حقن بدء يبلغ حوالي 30 رطل لكل بوصة مربعة واضبطه حسب الضرورة لتقديم حجم مناسب من مزيج الحقن. تحت مجهر التشريح ، ضع الإبرة فوق جنين البعوض ، واستخدم بعناية أداة المعالجة الدقيقة لخفض الإبرة على الجنين.

بمجرد أن تلمس الإبرة الجنين بالكاد ، حرك الجنين بسرعة بشكل عمودي على المحور الطويل للإبرة. لتحديد ما إذا كانت الإبرة قد تم فتحها بنجاح ، اضغط على مشغل الحقن ومعرفة ما إذا كانت أي فقاعات أو مزيج حقن يهرب من الإبرة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر تحريك جنين البعوض ضد الإبرة حتى يتم فتحها ويهرب مزيج الحقن عند الضغط على الزناد.

ضع أول جنين بعوض في وسط الرؤية ، وتأكد من أنه في بؤرة التركيز وضع الإبرة فوق البويضة الأولى. قم بزيادة التكبير تدريجيا على المجهر ، وخفض الإبرة بعناية لإبقائها فوق الجنين الأول مباشرة. استمر حتى يصل المجهر إلى أعلى تكبير له ، ويكون كل من الجنين والإبرة في بؤرة التركيز.

حرك الجنين قليلا إلى اليسار وخفض الإبرة بحيث تكون في نفس مستوى رؤية الجنين. استخدم مرحلة المجهر للمس الجنين برفق على طرف الإبرة. يجب أن ينحرف الطرف الخلفي الضيق لجنين البعوض قليلا.

باستخدام مرحلة المجهر ، حرك الطرف الخلفي للجنين على الإبرة ولاحظ الإبرة تخترق مشيضة بيضة البعوض. يجب أن تخترق الإبرة الغشاء والموقع التقريبي للخلايا القطبية داخل الجنين. وضع مزيج الحقن في هذه المنطقة ، يزيد من احتمالية حدوث الطفرات وتوريثها في السلالة الجرثومة.

اسحب زناد الحقن مرة إلى ثلاث مرات لإطلاق مزيج الحقن في الجنين. قم بتوصيل كمية صغيرة من مزيج الحقن ، بما يكفي فقط بحيث يمكن اكتشاف مقاصة صغيرة في بلازما الجنين. استخدم المرحلة لتحريك الجنين إلى اليمين والبعيد وبعيدا عن طرف الإبرة.

إذا سارت الحقنة على ما يرام ، يجب أن يتسرب القليل من السوائل من الجنين. حرك المرحلة لأسفل بحيث يتم وضع الجنين التالي أمام الإبرة. وكرر الحقن.

إذا لم يبد أن مزيج الحقن يخرج ، أو إذا هربت كمية كبيرة من السائل من الجنين بعد إزالة الإبرة ، فاستبدل إبرة الحقن وابدأ من جديد. تدمير أي بيض غير محقون أو تالف. بعد حقن جميع الأجنة الموجودة على الشريحة ، اغسل زيت الهالوكربون عن طريق تطبيق ماء التناضح العكسي بزجاجة بخ.

قم بتوجيه تيار الماء إلى الجزء العلوي من الغطاء الزجاجي الذي ينزلق فوق الأجنة المحقونة واسمح للماء بالتدفق أسفل زلة الغطاء ، مع التأكد من عدم توجيه التيار إلى الأجنة. قم بتغطية الشريحة ب 150 ميكرولتر من الماء وضعها على ورق ترشيح مبلل داخل طبق بتري مربع. احتضان طبق بتري في غرفة بيئية ، مضبوطة على 25 إلى 27 درجة مئوية و 70 إلى 80٪ رطوبة نسبية مع فترة ضوئية طويلة اليوم.

تم استخدام هذا البروتوكول لحقن أجنة بعوض المنزل الشمالي بنجاح ، Culex pipiens لضمان أن الطرف الأمامي لجنين البعوض يمتد إلى ما وراء شريط الضمادات الطبية ، مما يزيد بشكل كبير من بقاء اليرقات وينتج عنه ذرية عالية الجودة قادرة على التطور إلى مرحلة البلوغ والتكاثر. كشف التسلسل ، أن ما يقرب من 10٪ من البعوض الذي تم فحصه أظهر إدخالا أو حذفا صغيرا بالقرب من موقع قطع Cas9 للدليل الأول للحمض النووي الريبي ، مما يشير إلى أن الخلايا القطبية قد تم استهدافها بنجاح أثناء الحقن الدقيق. نجح أفراد F1 في التزاوج وإنتاج ذرية قابلة للحياة ، بعضها احتوى أيضا على الطفرة.

أجنة الحشرات الدقيقة ، يعاني معظم الناس من فتح الإبرة في البداية وتحريك الجنين إلى الإبرة. تذكر أن تطوير هذه المهارات يستغرق وقتا وممارسة. يمكن تعديل هذا البروتوكول أو تكييفه لحقن أجنة البعوض الآخر أو حتى أنواع الحشرات الأخرى.

بالإضافة إلى استخدام هذا البروتوكول للتخلص من الجينات من خلال تحرير الجينوم المستهدف CRISPR-Cas9 ، يمكن استخدام نفس التقنيات لحقن البلازميدات أو الينقولات إما للجينات أو توليد طفرات عشوائية. يستخدم مختبري حاليا هذه التقنية لفهم كيفية قياس البعوض يوميا وتنظيم استجاباته الموسمية بشكل أفضل. ومع ذلك ، كيف نستخدم نحن الباحثون تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 لفهم بيولوجيا العديد من الكائنات الحية بشكل أفضل.