تبلور البروتينات على رقاقة عن طريق المجهر دراسات الحيود في الموقع بالأشعة السينية

تصف هذه الورقة بروتوكول تصنيع رقائق microfluidic التي تم تطويرها لتبلور البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى وتجارب الحيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الرقائق الدقيقة هي اختيار مواد التصنيع ، مما يجعل الرقائق متوافقة مع جمع بيانات حيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة. تتطلب تجارب التبلور على الشريحة كميات صغيرة من عينة البروتين ، مما يقلل من التكلفة الإجمالية للعمل مع هذه الجزيئات الكبيرة ذات القيمة العالية.

تبلور على رقاقة يلغي أيضا الحصاد اليدوي من بلورات البروتين الهشة، وكثيرا ما تطبق في تركيبة مع التبريد بالتبريد خلال التجارب البلورية التقليدية. وعلاوة على ذلك، تستخدم رقاقاتنا الدقيقة الغسيل الدقيق لبلورة البروتين، وهي طريقة قائمة على الانتشار تهدف إلى توازن التركيز المتسرعة من خلال غشاء شبه نفاذية، من أجل الاقتراب من التركيز المتمائم لتبلور البروتين، وتمكن من التحكم الدقيق والعادي في ظروف التبلور. يمكن استخدام غسيل الكلى الدقيق جنبا إلى جنب مع التحكم في درجة الحرارة لفصل النوى عن نمو الكريستال للتحقيق في مخططات المرحلة ، عن طريق تغيير التركيز المتعجل أثناء استخدام عينة البروتين نفسها.

أولا إعداد 50 غراما من قاعدة السيليكون PDMS وانها عامل علاج في نسبة كتلة 10 إلى واحد. اخلطي المكونين في كوب مع ملعقة. بعد خلط، وضع الخليط في غرفة فراغ من أجل إزالة جميع فقاعات الهواء.

وضع 25 غراما من PDMS premixed في SU8 الأولى لإتقان تحتوي على أنماط القناة microfluidic والأعمدة، تصل إلى ارتفاع ما يقرب من خمسة ملليمترات. ثم صب 25 غراما المتبقية من PDMS في سيد SU8 الثاني، التي تحتوي فقط على أنماط من الأعمدة. علاج طبقتين PDMS في الفرن في 338 كلفن لمدة ساعة واحدة.

قطع طبقات PDMS الشفاء حول أنماط الماجستير SU8 مع مشرط، وتقشير بلطف قبالة قوالب PDMS من سادة السيليكون. ضع قالب PDMS ، ويضم كل من القنوات والأعمدة على شريحة زجاجية مجهر جامدة مع الأنماط التي تواجه صعودا. قطع قطعة صغيرة من تجديد غشاء غسيل الكلى السليلوز من أجل تغطية الركيزة المركزية للقالب PDMS، والتي تم تصميمها لتكون غرفة البروتين.

يتم اختيار قطع الوزن الجزيئي لغشاء غسيل الكلى وفقا للوزن الجزيئي لعينة البروتين ، ومثبطات محلول التبلور. ثم فصل بعناية قطعة جافة من غشاء غسيل الكلى السليلوز المجددة. قطع قطعة صغيرة من غشاء غسيل الكلى المنفصل.

حجم هذه القطعة من الغشاء يعتمد على تصميم رقاقة. وعلى وجه التحديد، فإنه يعتمد على أبعاد الركيزة المركزية. إيداع قطعة من غشاء غسيل الكلى على الركيزة المركزية للقالب PDMS، الذي يدعم على الشريحة الزجاجية، مع عموده والقنوات التي تواجه صعودا.

ثم ضع العفن PDMS الثاني يضم فقط الأعمدة التي تواجه إلى أسفل، على رأس العفن PDMS التي تدعمها بالفعل على الشريحة الزجاجية. محاذاة جميع أعمدة قوالب PDMS اثنين. تقع قطعة من غشاء غسيل الكلى السليلوز المجدد بين الركيزتين المركزيتين للقوالب PDMS.

يمكن إجراء هذه الخطوة من إجراء التصنيع تحت المجهر البصري أو ببساطة عن طريق الفحص البصري بعناية لمحاذاة جميع الأعمدة. ضع التجميع في غرفة فراغ وجفف لمدة 30 دقيقة من أجل إزالة فقاعات الهواء المحاصرين داخل قوالب PDMS ، وتعزيز إدخال راتنج NOA القابل للشفاء الضوئي ، الذي سيتم وصفه في الخطوة التالية من هذا البروتوكول. إزالة الجمعية من غرفة فراغ وملء المساحة الفارغة بين قوالب PDMS اثنين مع الراتنج القائمة على ثيولين photocurable، NOA 81، عن طريق imbibition الشعرية.

تطبيق الراتنج على ثلاثة من الجوانب الأربعة للجمعية. ضع التجميع في وصلة متقاطعة وعالج راتنج NOA عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثماني ثوان ، باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجمومة من 35 ملليواط لكل سنتيمتر مربع. قطع قطعة PMMA سميكة 175 ميكرومتر في الأبعاد القياسية للشريحة الزجاج المجهر، وقشر قبالة الحماية البلاستيكية من كل جانب من قطعة PMMA.

بمجرد الانتهاء من التعرض للأشعة فوق البنفسجية الأولى ، قم بإزالة قالب PDMS العلوي مع راتنج NOA مرتبط جزئيا عالق عليه من قالب PDMS السفلي والشريحة الزجاجية. اضغط بلطف على تجميع قالب PDMS العلوي وراتنج NOA المعالج جزئيا على قطعة PMMA. وضع التجميع الجديد في الرابط عبر وعلاج مرة أخرى راتنج NOA عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية.

إزالة بعناية القالب PDMS العليا. رقاقة غسيل الكلى المصنوعة من راتنج NOA عبر الارتباط بالكامل الذي يدمج غشاء غسيل الكلى السليلوز المجدد ويتم دعمه على قطعة PMMA جاهز. السندات الموصلات المتاحة تجاريا على مدخل ومنفذ نقاط القناة microfluidic مع الغراء الايبوكسي سريع.

للتعامل مع السوائل، اختر قطر أنابيب PTFE استنادا إلى حجم الموصلات. يتم استخدام الأنابيب لإدخال محلول التبلور داخل القناة السائلة لشريحة غسيل الكلى. ماصة يدويا قطرة من عينة البروتين داخل خزان البروتين الموجود مباشرة على غشاء غسيل الكلى.

يعتمد حجم قطرة البروتين على تصميم الرقاقة التي يتم استخدامها. وعلى وجه التحديد، فإنه يعتمد على حجم الدعامة المركزية، ويمكن أن يكون 0.1 أو 0.3 ميكرولتر. تطبيق بعناية طبقة رقيقة من الشحوم السيليكون فراغ عالية في جميع أنحاء خزان البروتين.

قطع قطعة صغيرة من PMMA ووضعها بلطف فوق طبقة رقيقة من الشحوم السيليكون. قطع قطعة من الشريط Kapton، كبيرة بما يكفي لتغطية قطعة PMMA وضعت فوق خزان البروتين والعصا على رقاقة NOA حول جميع الحواف. يتم تغليف عينة البروتين داخل الخزان ويمكن استخدام الشريحة لتجارب التبلور.

أولا إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر من الحل تبلور عن طريق خلط وحدات التخزين المناسبة من العازلة والحلول السريعة. حقن محلول التبلور في نقطة من رقاقة غسيل الكلى من خلال الموصلات السائلة، إما يدويا مع الحقنة أو مع نظام الضغط الآلي مدفوعة. بمجرد تعبئة القناة السائلة بمحلول التبلور ولا يوجد هواء محصور داخلها ، فقم بإغلاق منافذ مدخل ومنفذ الشريحة بشريط Parafilm.

ماصة الحجم المناسب من محلول البروتين داخل خزان البروتين وتغليف عينة البروتين كما سبق وصفه. يمكن تصور نمو بلور البروتين وتسجيله بكاميرا رقمية. لتصنيع رقائق غسيل الكلى، اخترنا مواد شفافة بصريا وغير خاملة بيولوجيا، مما يدل على التوافق عالية لتجارب الحيود الأشعة السينية في الموقع.

وقد تم تقييم الضوضاء الخلفية الناتجة عن المواد التي تتألف من مقصورة البروتين من رقاقة، والتي هي في المسار المباشر لشعاع الأشعة السينية. تتكون مقصورة البروتين من غشاء غسيل الكلى السليلوزي المجدد ، وشريط Kapton ، وطبقتين PMMA ، واحدة تستخدم كركيزة للرقائق الدقيقة ، وواحدة تستخدم لتغليف عينة البروتين. في هذه الصورة ، يتضح من الضوضاء الخلفية الناتجة عن الشريط Kapton ، وغشاء غسيل الكلى السليلوز المجددة ، وطبقة PMMA ، وتجميعها.

على الرغم من أن PHOTOCURABLE الراتنج NOA يضم الجسم الرئيسي للرقائق الدقيقة، لا يتم تضمينها في هذه القياسات لأنها ليست جزءا من غرفة البروتين. يمكن رؤية الحلقات المنتشرة المنسوبة إلى تفاعلات الأشعة السينية مع المواد لشريط Kapton بدقة أقل من أربعة angstroms ، وPMMA بين أربعة إلى ثمانية angstroms ، وغشاء غسيل الكلى بين أربعة إلى خمسة angstroms. ويلاحظ أساسا الضوضاء الخلفية الإجمالية الناتجة عن رقاقة في القرار أقل من ستة angstrom، مما يدل على أن علاج بيانات الحيود عالية الدقة lysozyme لا يتأثر.

تم تركيب الرقائق الدقيقة أمام شعاع الأشعة السينية مع دعم مطبوع ثلاثي الأبعاد قمنا بتصميمه لتجارب الحيود بالأشعة السينية في الموقع ، ويمكن أن يحمل ما يصل إلى ثلاث رقائق في وقت واحد. وأجريت تجارب من أجل تقييم كفاءة الرقائق الدقيقة لبلورة البروتينات القابلة للذوبان في النموذج باستخدام طريقة التحليل الدقيق. نمت بلورات lysozyme في 293 كلفن في حالتين مختلفتين.

احتوت حالة التبلور الأولى على 1.5 كلوريد صوديوم مولار، و0.1 خلات صوديوم مولار. أما حالة التبلور الثانية فقد احتوت على كلوريد صوديوم مولار واحد، و0.1 خلات صوديوم مولار، و30٪ بولي إيثيلين جليكول 400، وتم اختيارها لإظهار توافق الرقائق الدقيقة وطريقة غسيل الكلى الدقيق، مع مثبطات ذات وزن جزيئي مرتفع وحلول لزجة. وقد أجريت تجارب التبلور في ظل ظروف ثابتة.

وبمجرد أن نمت بلورات lysozyme على رقاقة، كانت تستخدم لتجارب الحيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة. تم تركيب الرقائق الدقيقة عند خط الحزمة بمساعدة الدعم المطبوع ثلاثي الأبعاد وتم جمع مجموعات بيانات حيود الأشعة السينية الكاملة من بلورتين lysozyme. بعد معالجة بيانات حيود الأشعة السينية، تم الحصول على خريطة كثافة الإلكترون لبلورة lysozyme واحدة بدقة 1.95 angstrom، كما هو موضح في الشكل A.Figure B تظهر خريطة كثافة الإلكترون التي تم الحصول عليها بدقة 1.85 angstroms.

بعد دمج مجموعتي بيانات تم الحصول عليهما من بلورتين مختلفتين من الليسوزيم، تظهر كل من خرائط الكثافة الكهربائية معلومات هيكلية مفصلة يمكن الحصول عليها من خلال تجارب حيود الأشعة السينية الموقعية التي أجريت مباشرة على رقائق غسيل الكلى في درجة حرارة الغرفة، من بلورات بروتين واحدة أو متعددة. لقد أثبتنا إجراء التصنيع لأجهزة microfluidic المصممة لبلورة البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى الدقيق، وفي الموقع تجارب الحيود الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة. استخدمنا مواد التصنيع مع شفافية عالية الأشعة السينية، متوافقة مع البلورات البروتين في الموقع.

جمع البيانات الحيود هو الآلي مع استخدام دعم المطبوعة 3D للرقائق، التي يمكن تركيبها مباشرة في خطوط شعاع البلورات الجزيئية الكلية. تنبع براعة هذه الشريحة الدقيقة من استخدام غسيل الكلى الدقيق للتحكم بشكل عكسي في ظروف التبلور ورسم مخططات مرحلة الخريطة باستخدام حجم البروتين الصغير. النماذج الأولية للجهاز واضحة ، مما يتيح تصنيع ما يصل إلى 30 رقاقة في يوم واحد في غرفة نظيفة ، مع مواد غير مكلفة نسبيا.

ونتوقع أن هذه الميزات من رقائق يمكن استخدامها لدراسات الأشعة السينية المسلسل البلورات من أهداف البروتين أكثر تحديا.