سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف

تنمو الأنسجة البيولوجية في بيئات ناعمة ثلاثية الأبعاد تتعرض من خلالها الخلايا لإشارات ميكانيكية مختلفة. تسمح طريقتنا بتمدد الهلاميات المائية بطريقة ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الاستجابات الميكانيكية الحيوية. تتيح هذه التقنية التمدد المنتظم للهلاميات المائية على طول سمكها أثناء إجراء التصوير المباشر.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب بهندسة الهيدروجيل بأي حجم أو شكل. تعد المعرفة حول كيفية استجابة الخلايا والمصفوفة خارج الخلية للقوى مهمة للكشف عن كيفية تطور الأنسجة وتطور الأمراض. يمكن أن يؤدي هذا إلى تطوير محتمل لعلاجات السرطان ونماذج هندسة الأنسجة.

ابدأ باستخدام الليزر أو القاطع اليدوي لإنشاء شريط مطاطي به ثقب في المنتصف. قم بقص مستطيل من الفيلم الكارهة للماء بحيث يكون أعرض من شرائط السيليكون واغسل طبقا بلاستيكيا بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد التجفيف بمناديل خالية من النسالة ، ضع طبقة الختم في الطبق وضع شريط سيليكون واحد مع إزالة الغلاف البلاستيكي من جانب واحد في وسط كل قطعة من فيلم الختم.

لتكوين هلام الفيبرين ، قم بتوصيل 2.5 ميكرولتر من الفيبرينوجين الملصق على البارد بشكل موحد في فتحة السيليكون لكل شريط بحيث يكون محيط كل فتحة بالكامل ملامسا للفيبرينوجين ، مع الحرص على عدم السماح لأي جيوب هوائية أو فقاعات بالتشكل في أي مكان في المحاليل. أضف على الفور 2.5 ميكرولتر من الثرومبين المبرد مباشرة إلى كل محلول فيبرينوجين واخلط المحاليل بسرعة مع سحب العينات الدقيق، مع تحريك الطرف حول الخليط بأكمله لإنشاء محلول متجانس قدر الإمكان. بعد الخلط ، ضع الطبق المغطى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة لبلمرة الجل.

في نهاية الحضانة ، أضف ما يكفي من PBS إلى الطبق لغمر تركيبات السيليكون الهلامية ورفع كل عينة بعناية من الطبق ، مع التأكد من بقاء طبقة فيلم الختم ملتصقة بالشريط. قم بالتقشير ببطء من أحد طرفي السيليكون إلى الطرف الآخر ، وافصل فيلم الختم بعناية عن كل قطعة من السيليكون ، ثم ضع الشريط مرة أخرى في الطبق وضع الطبق على مسرح المجهر الضوئي لتقييم حالة العينة. لتحميل العينة على جهاز التمدد ، املأ الحمام ب PBS وضع شريط السيليكون الذي يحتوي على عينة جل عبر الجزء العلوي من الحمام بحيث تكون نهايات الشريط موجودة على كل جانب من جوانب الحمام.

ضع المشابك وشرائط القماش ، ثم شدها بحيث يتم توصيل جميع القطع لتشكيل شريط مستقيم واحد مع الفتحة في المنتصف. ضع المادة على البئر وقم بتأمين زلة غطاء في قاع البئر ، ثم ضع سائل الألومنيوم جيدا في جهاز التمدد. املأ البئر بواحد إلى ملليلتر من وسط خلية PBS وضع هيكل هلام النسيج الشريطي في الجهاز.

قم بتثبيت شريط القماش في الحامل بحيث يكون فتحة الجل في المنتصف قبل وضع الدبوس لأسفل بعناية وقفله في مكانه في الجهاز. ضع جانب القماش الآخر وأغلقه في المغزل وضع جهاز التمدد والعينة المرفقة على مرحلة المجهر متحد البؤر. استخدم كبل USB لتوصيل وحدة التحكم الدقيقة بالكمبيوتر وتوصيل محرك سيرفو بوحدة التحكم.

ثم افتح وحدة التحكم في جهاز التمدد على الكمبيوتر لتصوير العينة. لتحديد ما إذا كانت العينة مناسبة للتجربة ، استخدم التصوير الحي منخفض الدقة لمسح الجل بالكامل وتحديد أدنى موضع Z يظهر عنده الالتصاق الكامل بالجدران الداخلية للفتحة بدون تمزقات أو فقاعات. بعد ملاحظة موقع Z للمجهر ، امسح واجهة ملصق الفلورسنت للهلام وشريط السيليكون لتحديد الالتصاق الكامل للهلام بالسيليكون طوال محيطه.

بعد المسح ، حرك المرحلة في الاتجاه Z حتى تختفي الاستمرارية في الجل ولاحظ الحد الأعلى لموضع Z. ثم اطرح الحد الأعلى للاتجاه Z من الحد الأدنى لحساب سمك العينة. لتحديد موضع ما قبل التمدد للعينة ، انقر فوق الانتقال إلى Zero Servo POS في برنامج الوحدة النمطية للتأكد من أن المحرك المؤازر في موضعه الصفري وقم بتوصيل المحرك المؤازر بجهاز التمدد ، مع الحرص على عدم وضع أي ضغط على العينة.

أثناء التصوير ، انقر فوق الزر زائد واحد لتحريك المحرك درجة واحدة في كل مرة في اتجاه عقارب الساعة. عندما يتحرك الجانب الأيمن من الفتحة ، انقر فوق الزر ناقص واحد لعكس العينة إلى الموضع قبل الأخير للحفاظ على العينة تحت الحد الأدنى من التوتر. انقر فوق تعيين الحد الأدنى لموضع المؤازرة لتعيين الموضع المرجعي والتقاط صورة تجانب شريحة Z واحدة للتكبير بمقدار 40 مرة وعالية الدقة لمنطقة الهلام بأكملها كمرجع أساسي لتحليل ما بعد المعالجة.

عندما يتم الحصول على جميع الصور ، قم بتقدم محرك سيرفو درجة واحدة في الثانية حتى يتم الوصول إلى حجم التمدد المطلوب. عند كل حجم امتداد مطلوب إجراء تحليل له ، تحقق من أن الجل لم ينفصل عن السيليكون في أي وقت طوال محيطه عن طريق مسح الواجهة بين الجل والسيليكون ، ثم التقط مجموعة صور مكدس Z عالية الدقة من منطقة الهلام بأكملها لتحليل ما بعد المعالجة. يسمح تكبير مجاميع الخرز وتتبعها يدويا أثناء تمدد الهلام بحساب سلالات الهلام المحلية في الاتجاهين المحوري والعمودي.

عادة ما تنتشر الخيوط المحورية خطيا نسبيا من حافة قطع السيليكون إلى مركز الجل وتكون أكبر من السلالات العمودية الضاغطة. هنا ، يتم عرض صور التكبير العالية لهيدروجيل نموذجي غير ممتد ومنظحي نسبيا ، وهيدروجين تحت سلالة انقطاع عالية بنسبة 80٪ تصور أليافا عالية المحاذاة في اتجاه التمدد. كشف تحليل إعادة توجيه الألياف عن اعتماد خطي تقريبا بين محاذاة الألياف والضغط الخارجي على الفتحة حتى سلالات تصل إلى 40٪ مع تشبع معتدل عند سلالات أعلى من 40٪ كما هو موضح في تحليل محاذاة الألياف هذا ، مع زيادة الضغط الخارجي على القطع ، تزداد محاذاة الألياف ، بعد منحنى غير خطي شامل.

لاحظ أن استجابة الهلام للتمدد موحدة نسبيا على طول سمك Z. كما هو موضح في هذه المحاكاة الأولية للعناصر المحدودة التي تم إجراؤها على مادة مستمرة ثنائية الأبعاد ، تتراوح حصيرة اللون من 38 إلى 42٪ مما يشير إلى أن سلالات الهلام متجانسة نسبيا في جميع أنحاء منطقة الهلام الدائرية. من المهم التأكد من أن الهيدروجيل يلتصق تماما بالجدران الداخلية للفتحة الهندسية ، حيث أن الالتصاق والاستمرارية أمران حاسمان للتمدد الموثوق للعينات.

من خلال تعديل هندسة انقطاع السيليكون ، يمكننا برمجة التدرجات في محاذاة الإجهاد والألياف ، لذلك عند تضمين الخلايا يمكننا تحليل الاستجابة لهذه التدرجات.