في فحص Vivo CRISPR/Cas9 لتقييم وظيفة الجينات في وقت واحد في جلد الماوس وتجويف الفم
نوفمبر 2, 2020
هنا نصف منهجية فحص سريعة ومباشرة في vivo CRISPR/Cas9 باستخدام الحقن العدسية الجنينية الموجهة بالموجات فوق الصوتية لتقييم وظائف العديد من الجينات في الجلد وتجويف الفم للفئران ذات القدرة المناعية في وقت واحد.
هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للباحثين بالتحقيق في نفس الوقت في الوظائف المثبطة للورم لمئات الجينات في سرطان الرأس والرقبة بجزء بسيط من تكلفة نموذج الفأر بالضربة القاضية التقليدي. هذه التقنية مرنة ويمكن تكييفها لتغطية التعبير عن الجينات لدراسة وظيفتها في الجلد. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول مكتبة كريسبر المستهدف على أنواع السرطان الأخرى.
ضع الجانب البطني للحيوان المخدر لأعلى في مرحلة الجراحة الساخنة واستخدم شريطا جراحيا لتثبيت الكفوف في مكانها. ضع أنبوب التخدير المخروطي للحصول على إمداد مستمر بالأيزوفلوران والأكسجين حتى تكتمل الجراحة. لتأكيد الحمل E9.5 ، ضعي كمية صغيرة من كريم إزالة الشعر على البطن ووزعيه على مساحة ثلاثة × ثلاثة سنتيمترات مربعة باستخدام قضيب قطني.
بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، قم بإزالة الكريم برفق بشاش أو منديل وامسح المنطقة نظيفة باستخدام PBS و 70٪ إيثانول. باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية والهلام ، افحص الفأر الحامل بحثا عن اليوم الجنيني E9.5. يمكن القيام بذلك أيضا في اليوم السابق في E8.5 لتوفير الوقت في يوم الجراحة.
قم بإزالة جل الموجات فوق الصوتية وامسح المنطقة نظيفة باستخدام BPS ثم 70٪ إيثانول. حقن أكثر من مسكن تحت الجلد. ثم تقوم بتعقيم الملقط والمقص لعمل شق عمودي في الجلد.
استخدم ملقطا غير حاد لفصل الجلد حول الشق عن الصفاق. ثم تقوم بتعقيم الملقط والمقص لقطع الصفاق. باستخدام ملقط حاد ، اسحب قرن الرحم الأيمن والأيسر برفق وعد الأجنة.
أعد إدخال معظم قرون الرحم ، لكن اترك الطرف البعيد لقرن الرحم الذي يحتوي على ثلاثة أجنة مكشوفا. باستخدام ملقط حاد ، ادفع الرحم واسحبه برفق مع الأجنة الثلاثة ، من خلال الفتحة الموجودة في غشاء السيليكون لطبق بتري المعدل. قم بتثبيت طبق بتري باستخدام مكعبات من طين النمذجة.
ثبت الرحم مع الأجنة الثلاثة داخل طبق بتري ، باستخدام قالب سيليكون. ثم قم بتسطيح سدادة السيليكون على جانب الأجنة باستخدام أداة حادة. املأ طبق بتري ب PBS معقم واغسل غشاء السيليكون في قاع طبق بتري ، ببطن السد الحامل ، وبالتالي منع أي تسرب.
حرك رأس الموجات فوق الصوتية إلى طبق بتري ، على ارتفاع 0.5 سم تقريبا فوق الجنين العلوي واضبط المرحلة بحيث يصبح التجويف الأمنيوسي مرئيا بوضوح في عرض الموجات فوق الصوتية. قم بمحاذاة إبرة الحاقن بعناية في طبق بتري المعدل. باستخدام المعالج الدقيق ، ضع طرف الإبرة في حدود خمسة ملليمترات من الجنين العلوي ، ثم قم بتبديل الإبرة ذهابا وإيابا للانتقال إلى المستوى حيث يظهر طرفها الأكثر سطوعا في صورة الموجات فوق الصوتية.
باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، ادفع الإبرة عبر جدار الرحم إلى التجويف الأمنيوسي. حقن 62 نانولترا من الفيروس العدسي بمكتبة sgRNA بسرعة حقن بطيئة. اضغط على زر الحقن ثماني مرات ليصبح المجموع 496 نانولترا لكل جنين.
كرر نفس الإجراء مع الجنينين الآخرين. ثم ارفع رأس الموجات فوق الصوتية وقم بإزالة سدادة السيليكون. دفع أول اثنين من الأجنة الثلاثة برفق إلى بطن الفأر باستخدام قطعة قطن معقمة.
اسحب الأجنة الثلاثة التالية وادفع الجنين الثالث الذي تم حقنه مسبقا. كرر إجراء الحقن حتى يتم حقن العدد المطلوب من الأجنة ، مع التأكد من عدم تجاوز 30 دقيقة من التخدير. عند الانتهاء ، ارفع رأس الموجات فوق الصوتية ، وقم بإزالة المعالج الدقيق بالإبرة ، وشفط PBS وإزالة طبق بتري.
باستخدام مناديل معقمة ، امتصاص أي PBS قد يكون قد تراكم في تجويف البطن. أغلق الشق البريتوني باستخدام خيوط قابلة للامتصاص. ثم استخدم دبابيسين لإغلاق الشق في جلد البطن.
بعد ذلك ، يجب أن تظهر قراءات تسلسل الجيل للحمض النووي المضخم PCR من الخلايا المنقولة في مكتبة البلازميد والفيروسات العدسية ارتباطا عاليا. إذا كانت قراءات sgRNA من الحمض النووي البلازميد لا تظهر تمثيلا متساويا ل sgRNAs ، فيجب تكرار إجراء تحضير الفيروس وتركيزه بعناية. تظهر هنا نتائج الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لفيروس العدسات الذي يحمل Cre recombinase في صغار الفأر E9.5 Lox-STOP-Lox في يوم ما بعد الولادة P0.
في حين أن العيار العالي للفيروس سيؤدي إلى تغطية أكبر لجلد الفأر ، إلا أنه سيؤدي أيضا إلى نقل العديد من الحمض النووي الريبي إلى نفس الخلية. تظهر هذه المؤامرة قراءات تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي المضخم بتفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الخلايا المنقولة في مكتبة البلازميد والفيروسات العدسية ، بالإضافة إلى قراءات من أربعة أورام تمثيلية. يتم إثراء أدلة sgRNA التي تستهدف مثبطات الورم ADAM10 و RIPK4 في عينات الورم مقارنة بتجمع البلازميد أو الخلايا المصابة.
يعد إجراء الجراحة في E9.5 أمرا بالغ الأهمية. تذكر التحقق من الحمل بالموجات فوق الصوتية ، بعد تسعة أيام من إعداد الصليب وتحديد النقطة الزمنية الجنينية في كل أنثى فأر. بمجرد ولادة الجراء ، يمكن عزل الخلايا المنقولة وتحديدها على نطاق واسع باستخدام أحدث تقنيات التنميط الجيني مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول منهجية سريعة ومباشرة لفحص CRISPR/Cas9 في الجسم الحي باستخدام حقن فيروسات عدسية لقاحية داخل الرحم تحت توجيه الموجات فوق الصوتية. يسمح للبحوث بتقييم وظائف عدة جينات في الجلد وتجويف الفم للفئران المناعية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- بحوث السرطان
الخلفية
- تمكن التقنية من اختبار وظائف قمع الورم لمئات من الجينات.
- إنها فعالة من حيث التكلفة مقارنة بنماذج الفئران المعدلة وراثيًا التقليدية.
- الطريقة قابلة للتكيف لدراسة التعبير الجيني في الجلد.
- يمكن تطبيقها على أنواع مختلفة من السرطان.
غرض الدراسة
- لتطوير منهجية لتقييم وظيفة الجين في وقت واحد.
- لتعزيز فهم أدوار الجينات في سرطان الرأس والعنق.
- لتوفير أداة مرنة لبحوث السرطان.
الطرق المستخدمة
- حقن فيروسات عدسية لقاحية داخل الرحم تحت توجيه الموجات فوق الصوتية.
- استخدام الأيزوفلوران والأكسجين للتخدير.
- تأكيد الحمل عبر تطبيق كريم إزالة الشعر.
- استخدام بروتوكول مكتبة CRISPR المستهدفة.
النتائج الرئيسية
- تقييم ناجح لوظائف الجينات في الجسم الحي.
- تبين الفعالية من حيث التكلفة للطريقة.
- تأكيد قابلية التكيف لأنواع مختلفة من السرطان.
- إمكانية الاستخدام الأوسع في دراسات وظيفة الجينات.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول نهجًا سريعًا وفعالًا لتحليل وظيفة الجين.
- يفتح مسارات جديدة لبحوث السرطان ودراسات الجينات.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى ما وراء سرطان الرأس والعنق.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
In vivo CRISPR/Cas9 screening enables rapid, multiplexed functional interrogation of gene roles in disease-relevant mouse tissues, accelerating target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This approach reduces the time and cost barriers of traditional GEMMs, supporting earlier, data-driven portfolio triage and prioritization. Its adaptability across tissues and gene perturbation types positions it as a scalable platform for preclinical model innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables simultaneous functional assessment of hundreds of candidate tumor suppressor genes in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in tissue-specific oncogenesis.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target prioritization for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated, multiplexed knockout models for robust screening of gene function.
- Provides quantitative readouts via next-generation sequencing of sgRNA representation.
- Improves reproducibility and scalability compared to single-gene knockout workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease biology by enabling tissue- and context-specific gene perturbation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling single-cell profiling of transduced cells.
- Reduces late-stage attrition risk by providing early, in vivo functional evidence for candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo CRISPR screening method bridges early discovery and preclinical model development, enabling direct functional genomics in relevant tissues before lead identification.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function testing and pathway mapping in disease-relevant systems.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for robust comparison of gene perturbations.
- Analytics: Leverages next-generation sequencing for precise measurement of sgRNA enrichment and depletion.
- Translational Research: Supports biomarker discovery and mechanistic alignment with clinical phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues, gene sets, and disease models across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and enables high-throughput functional genomics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing early, multiplexed in vivo data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero surgery, CRISPR library design, and next-generation sequencing analytics.
- Demands access to ultrasound-guided injection systems and high-titer lentiviral production capabilities.
- Standardization of sgRNA library representation and viral delivery is critical for reproducibility.
- Protocol can be adapted to other organs or CRISPR modalities with appropriate optimization.
- Careful control of viral titer and injection parameters is necessary to avoid confounding effects from multiple sgRNA integration.
