توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

المتوقع أن تسهل البروتوكولات الموضحة هنا الدراسات المستقبلية حول عيوب قليلة التغصن ، في التسبب في التنكس العصبي. هذه طريقة محسنة يمكن استخدامها لتوليد خلايا نسب الخلايا الدبقية قليلة التغصن البشرية الوظيفية في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع فقط ، وإنشاء نظام ثقافة مشتركة لنمذجة اتصالات الخلايا العصبية قليلة التغصن. يمكن استخدام البروتوكول لدراسة ليس فقط مرض الزهايمر, ولكن أي جانب آخر مرتبط بالمرض من تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن.

للبدء ، قم بوضع ما يقرب من مليون خلية HEK293T في كل قارورة T75 لتحقيق التقاء بنسبة 40٪ ، ثم قم بنقلها بالبلازميدات التي تعبر عن التتراسيكلين المحفز NGN2 وجين منشط التتراسيكلين المقاوم للبورومايسين ، جنبا إلى جنب مع البلازميدات المساعدة الثلاثة. استخدم PEI للتعداد. قم بتغيير الوسائط بعد 16 ساعة.

أطلقت Harvest جزيئات فيروسية عن طريق جمع وسائط الاستزراع كل يوم واستبدالها بوسائط جديدة لمدة ثلاثة أيام. قم بتجميع الوسائط المجمعة للتنقية ، ثم قم بتصفية الفيروس من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند 49،000 مرة G لمدة 90 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات بالحجم المناسب من الجلوكوز PBS.

استخدم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H1 المتوفرة تجاريا لإجراء تحريض الخلايا العصبية. قم بزراعة الخلايا على محلول مصفوفة خارج الخلية مطلي بألواح 6 آبار بوسيط صيانة ESL واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قبل يومين من تحريض التمايز ، افصل الخلايا الجذعية الجنينية عن طريق إضافة مليلتر واحد من محلول انفصال الخلية واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

انقل الخلايا إلى أنبوب ، ثم اغسل البئر بملليلترين من الوسائط وأضفها إلى نفس الأنبوب. الطرد المركزي للخلايا عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق الحبيبات في الوسائط وقم بوضع الخلايا على ألواح مصفوفة مطلية ب 6 آبار بكثافة جلوس واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.

في اليوم التالي ، أضف فيروسات العدسات ، معبرا عن NGN2 بالإضافة إلى بورو. R ، ومنشط التتراسيكلين مع البوليبرين في وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية الطازجة. في اليوم صفر ، أضف ميكروغرامين لكل مليلتر دوكسيسيكلين في وسط DMEM / F-12 مكمل ب N2 وبدون مورفوجينات.

في اليوم الأول، أضف بورومايسين في DMEM/F-12 الطازج، بالإضافة إلى N2 والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي البالغ ميكروغرام واحد لكل مليلتر. حدد الخلايا المنقولة في بورومايسين لمدة 24 ساعة على الأقل. في اليوم الثاني ، افصل الخلايا العصبية المتمايزة بمحلول انفصال الخلية وأعد لصقها على ألواح ذات 24 بئرا مطلية بمحلول مصفوفة.

احتفظ بها في وسط ماجستير في إدارة الأعمال B27 بدون دوكسيسيكلين. استزراع الخلايا العصبية المستحثة النقية على الصفائح ، المغلفة بمحاليل قائمة على المصفوفة خارج الخلية. لإجراء توليد الخلايا السلفية العصبية ، قم بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H1 وتحويلها إلى خلايا سلفة عصبية ، كما هو موضح في المخطوطة النصية.

في اليوم السالب الأول ، قم بزرع 0.5 إلى مليون خلية في وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية في كل بئر من صفيحة 6 آبار مغطاة بمحلول مصفوفة منخفض عامل النمو. في اليوم صفر ، عالج الخلايا لمدة 24 ساعة باستخدام وسيط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية المكمل بنسبة 2٪ DMSO. في الأيام من الأول إلى السادس ، قم بتغيير الوسائط الكاملة بوسط الحث العصبي الدافئ الذي يحتوي على بعض مثبطات الإضافة من مجموعة تجارية.

في اليوم السابع ، قم بتمرير الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام محلول انفصال الخلية وقم بصفيحها بكثافة جلوس من واحد إلى ضعفين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. فحص كفاءة التمايز عن طريق التلوين الكيميائي المناعي لعدم وجود علامة متعددة القدرات ووجود علامات NPC. لتوليد خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن ، قم بوضع الشخصيات غير القابلة للعب في وسط الحث العصبي الدافئ مع إضافة بعض المثبطات من مجموعة تجارية.

في اليوم الثامن ، قم بإعداد محلول 1٪ DMSO في وسط تمايز OPC ، وقم بمعالجة الشخصيات غير القابلة للعب المطلية لمدة 24 ساعة. في اليوم التاسع ، استبدل الوسائط بوسيط تمايز OPC جديد بدون DMSO ، ثم قم بتغذية الخلايا كل يومين حتى اليوم 15. إذا وصلت الخلايا إلى التقاء قبل اليوم 15 ، فقم بتمريرها إلى كثافة الجلوس من واحد إلى اثنين مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.

في اليوم 14 ، لوحة OPCs في وسط تمايز OPC بكثافة من واحد إلى ضعفين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر ، في صفيحة 24 بئرا. خلايا الاختبار لوجود علامات خاصة ب OPC عن طريق تلطيخ IHC أو qPCR ، ولعدم وجود علامات NPC. في اليوم 15، استبدل الوسائط بوسط نضج OL.

قم بتغيير الوسيط كل يومين أو كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، قم بتقسيمها بنسبة واحد إلى ثلاثة لما يصل إلى ممرين أو حتى يتباطأ انقسام الخلايا بشكل كبير. إذا انقسمت OPCs بسرعة كبيرة ووصلت إلى التقاء في أقل من ثلاثة أيام ، أضف Ara-C بتركيز اثنين إلى خمسة ميكرومولار لمدة يوم إلى ثلاثة أيام.

في اليوم 14 ، قم بوضع IOPCs بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في صفيحة 24 بئرا في وسط تمايز OPC. في اليوم التالي ، افصل الخلايا العصبية البشرية المستحثة بمحلول انفصال الخلية. أضف الخلايا العصبية إلى OPCs المستنبتة ، مع الطلاء بكثافة جلوس مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.

استخدام وسط الزراعة المشتركة التي تحتوي على وسيط عصبي القاعدي A ، وملحق 2٪ B27 ، و 100 نانوجرام لكل مليلتر T3 ثلاثي يودوثيرونين. قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل يومين. إذا تكاثرت OPCs بسرعة كبيرة ووصلت إلى التقاء في أقل من ثلاثة أيام ، أضف اثنين إلى خمسة ميكرومولار Ara-C.

من المهم أن تظهر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات درجة عالية من القدرة المتعددة للتوليد الناجح للخلايا العصبية المستحثة ، أو OPCs والخلايا الدبقية قليلة التغصن. لذلك ، يجب تلطيخ الخلايا لعلامات محددة ، مثل OCT-4 و SOX2 ، قبل البدء في أي من بروتوكولات الحث. تم استخدام خلايا H1 البشرية للحصول على الخلايا العصبية المثيرة للدماغ الأمامي.

بدأت الخلايا العصبية النقية في الثقافة في التعبير عن المشبك في واحد في اليوم 14 إلى 16. تم إنشاء IOPCs في غضون أسبوعين والخلايا قليلة التغصن الناضجة في أربعة إلى خمسة أسابيع. أثرى علاج DMSO عدد الخلايا في مرحلة G1 المبكرة لتحسين تكامل الإشارات.

تم الكشف عن علامات OPC محددة في وقت مبكر يصل إلى أسبوعين بعد طلاء خلايا ES H1. كان عدد IOPC في أسبوعين متجانسين إلى حد ما ، حيث كان أكثر من 95٪ من الخلايا إيجابية ل 04 تلطيخ ومستوى عال من التفاعل المناعي للعلامات الأخرى. بعد بدء نضوج الخلايا قليلة التغصن ، تم الكشف عن علامات خلايا الدبقية قليلة التغصن المحددة بدءا من اليوم 28.

يجب تحديد كثافة الطلاء المثالية للخلايا العصبية المستحثة ، و IOPCs ، بسلسلة من معايرة عدد الخلايا لتحقيق التمايز المناسب. بعد أربعة أسابيع ، في المزارع المشتركة ، يجب تمييز IOPCs بشكل كاف إلى خلايا قليلة التغصن الإيجابية لعلامات محددة مثل MBP. يمكن لنظام الزراعة المشتركة هذا أن يعزز عدد نقاط الاشتباك العصبي بقوة ، مما يشير إلى أن IOPCs توفر دعما عصبيا من خلال الاتصال الجسدي أو إطلاق العوامل الغذائية.

يمكن أن يكون هذا الإجراء الموصوف أكثر تعقيدا عن طريق إضافة أنواع مختلفة من خلايا الدماغ. على سبيل المثال ، اشتقت الخلايا الجذعية الخلايا النجمية البشرية لنمذجة جوانب جديدة من التفاعلات الدبقية العصبية في الصحة والمرض.