زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع

في المختبر أو شيدت نموذج البشرة البشرية وضعت لأول مرة في التسعينات بهدف أساسي لتطوير طرق اختبار بديلة للتجارب الحيوانية. هذه النماذج البشرة 3D تستخدم الآن عادة لاختبار كل من سلامة وفعالية المكونات التجميلية. في حين أنه يمكن شراؤها من العديد من موردي الأنسجة، والقدرة على إعادة تشكيل نموذج 3D في المختبر يعطي المزيد من المرونة إلى نقطة النهاية من الاهتمام.

هناك العديد من المقالات البحثية التي تصف بإيجاز بروتوكول إعادة تشكيل نموذج البشرة ثلاثي الأبعاد ، ولكن لم يكن هناك ، حتى الآن ، أي فيديو متاح يظهر الخطوات الحاسمة لعملية إعادة التشكيل. هذا هو السبب وراء نشر هذه الورقة الفيديو. إعداد البشرة البشرية التي أعيد بناؤها في المنزل يسمح بالكثير من الحرية في عملية زراعة الطبيعة ، مثل التغييرات في التركيب المتوسط للثقافة ، ومشغلات الإجهاد المؤيدة للالتهابات أو التأكسدية ، وإسكات الجينات ذات الاهتمام ، وتثبيط أو تحفيز بعض العمليات البيولوجية.

للبدء، إذابة قارورة مع 1 مليون كريات القرنية البشرة البشرية المحفوظة بالتبريد، أو NHEKs، في حمام مائي في 37 درجة مئوية عن طريق غمر جزء من القارورة في الماء. احتضان القارورة لمدة دقيقة إلى دقيقتين في حمام الماء، حتى فقط قطعة صغيرة من الجليد مرئية. Resuspend الخلايا بعناية فائقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات.

نقل تعليق الخلية إلى قارورتين T75 تحتوي على ما مجموعه 15 ملليلتر من وسيط ذوبان حذر مسبقا، مما أدى إلى كثافة البذر من 6.7 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع. ملء ما قبل 24 لوحات البئر مع 1.5 ملليلتر من المتوسط المغمورة، وذلك من الناحية المثالية باستخدام ماصة موزع. بعد زراعة الخلايا إلى التقاء 80٪، فهي جاهزة للبذر في إدراج لزراعة البشرة البشرية المعاد بناؤها، أو RHEs.

إزالة الوسط القاعدي من قوارير T75 مع NHEKs. شطف الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل الحارة إلى كل قارورة T75، ثم إزالة برنامج تلفزيوني من القوارير. إضافة 2 إلى ثلاثة ملليلترات من 0.05٪ تريبسين-EDTA pre-warmed إلى كل قارورة، مع التأكد من أن يتم توزيع حل التريبسين بالتساوي على منطقة ثقافة الخلية من القارورة.

ضع القوارير في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع دقائق ، ثم تحقق مما إذا كانت الخلايا تنفصل باستخدام المجهر عند تكبير 10 X. الراب قارورة لمساعدة الخلايا على الافراج عن سطح القارورة. بمجرد فصل جميع الخلايا، أضف حجما متساويا من مثبط التريبسين الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل قارورة T75، ونقل تعليق الخلية من القوارير إلى أنبوب طرد مركزي.

شطف قوارير مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل الحارة ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على تعليق الخلية. الطرد المركزي الخلايا التي تم حصادها في 400 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل بعناية معظم supernatant ترك ما يقرب من 100 إلى 200 ميكرولتر في الأنبوب.

نفض الغبار بلطف أنبوب مع أصابعك لتخفيف بعناية بيليه. إعادة إنفاق بيليه الخلايا بلطف في حجم منخفض من المتوسط المغمورة، pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 10 مرات لضمان تعليق الخلية موحدة. ابدأ بحجم منخفض لتجنب تكوين مجاميع الخلايا، وأضف ما يصل إلى ملليلتر واحد من المتوسط المغمور لكل قارورة T75 أولية.

عد الخلايا في التعليق باستخدام طريقة استبعاد الأزرق تريبان. تمييع تعليق الخلية مع وسيطة مغمورة إضافية للوصول إلى تركيز 3.525 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر ، وذلك باستخدام المعادلة الأولى الواردة في مخطوطة النص. قم بإجراء تعداد خلية ثاني للمحلول المخفف واستخدم المعادلة الثانية في المخطوطة النصية لحساب حجم تعليق الخلية ليتم زرعه في إدراج الثقافة.

تعليق إدراج ثقافة البئر 24 في أعلى موقف من لوحة الناقل، ونقل لوحة الناقل إلى لوحة البئر 24 مليئة مسبقا مع المتوسط المغمورة. أضف الحجم المحدد لتعليق الخلية إلى كل إدراج، مع الحرص على عدم لمس الإدراج. بعد البذر، احتضان 24 لوحة بئر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتغلب على تأثير الحافة.

لا تحرك اللوحات خلال هذا الوقت. نقل لوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية، وتركها في ظروف مغمورة لمدة ثلاثة أيام. بعد حضانة لمدة ثلاثة أيام في حاضنة ثقافة الخلية ، يعرض الخلايا التي التزمت بسطح الغشاء إلى واجهة سائل الهواء ، أو ALI ، عن طريق إزالة الوسط المغمور من المقصورة apical مع نظام الطموح وماصة باستور زجاجية.

ملء لوحات جديدة 24 بئر مع 1.5 ملليلتر من المتوسطة ALI الطازجة قبل الحارة، ونقل لوحات الناقل مع إدراج الثقافة إلى لوحات جديدة متعددة الآبار. نقل لوحات متعددة الآبار مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية. تحديث المتوسطة ALI كل يومين إلى ثلاثة أيام، لمدة 14 يوما.

الخلايا الكيراتينية في الثقافة ثنائية الأبعاد تعرض مورفولوجيا تقليدية ذات شكل مضلع متسق. بعد 15 يوما في ALI ، تشكل البشرة البشرية المعاد بناؤها نسيجا طبقيا بالكامل ، والذي يشار إليه بطبقاته الأربع الرئيسية. يكشف التحليل الهيكلي الفائق للبشرة البشرية المعاد بناؤها في نقاط زمنية مختلفة في بروتوكول إعادة التشكيل عن عملية القرنية ، مع زيادة عدد طبقات موقع القرنية بمرور الوقت.

تظهر الكريات الكيراتينية في البشرة ملامح تعبير بروتين مختلفة وفقا لمرحلة التفريق. يظهر تعبير Involucrin بشكل أكثر غلبة في طبقة SG ، في حين يقع تعبير الفيلاغرين واللوريكرين في الطبقات العليا. تم العثور على تعبير الكيراتين-10 في جميع الطبقات القابلة للحياة باستثناء طبقة SB.

يعرض البشرة البشرية المعاد بناؤها تقاطعات ديسسومال وظيفية ، كما هو مبين في تعبير Desmoglein-1 في الفضاء بين الخلايا للطبقات البشرة القابلة للحياة. تم التحقيق في خصائص الحاجز لنموذج البشرة المعاد بناؤه من خلال تقييم صلاحية الأنسجة عند العلاج الموضعي مع تعطيل حاجز معروف ، وتقييم سلامة الأنسجة. تم تحديد سلامة الأنسجة بعد 15 يوما عن طريق قياس TEER مع فولتميتر.

تم التحقيق في استجابة البشرة لليبوبوليساكريد وعامل نخر الورم ألفا. وكانت كل من LPS والعلاجات ألفا TNF غير سامة. بالنسبة إلى عنصر تحكم تريتون X-100.

تم تحديد كمية إطلاق إنترلوكين-1 ألفا وإنترلوكين-8 في وسط RHE باستخدام تحلل IL. أدى علاج LPS إلى تنظيم تنظيمي مهم إحصائيا في إصدار إنترلوكين-1 ألفا وإنترلوكين-8. أدى العلاج ألفا TNF في تنظيم أعلى ذات دلالة إحصائية في الافراج فقط من انترلوكين-1 ألفا.

ومع ذلك، لوحظ أيضا ميل واضح لزيادة مستويات إنترلوكين-8 عند التحفيز مع TNF ألفا. باتباع هذا البروتوكول، يمكن قياس TEER كقيمة لسلامة الحاجز. يمكن قياس قابلية البقاء أو السمية الخلوية بواسطة اختبار MTT أو LDH ، على سبيل المثال.

يمكن استخدام الناتنات لقياس إفراز السيتوكينات أو البروتينات الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الأنسجة لدراسة التعبير عن البروتينات أو الجينات ذات الاهتمام.