تطوير واختبار المقايسات الكمية الخاصة ب PCR لتطبيقات الحمض النووي البيئي

المقايسات المحسنة جيدا أمرا حيويا للتفسير الصحيح لبيانات الحمض النووي البيئية. يصف هذا البروتوكول خطوات التصميم والاختبار اللازمة لتطوير مثل هذا الفحص. بشكل عام ، الحمض النووي البيئي هو طريقة غير جراحية للكشف عن نوع معين أو مجموعة من الأنواع.

قد يقلل من التكاليف ويكون أكثر حساسية مقارنة بطرق المسح التقليدية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الحفاظ على الحياة البرية وإدارتها من خلال الكشف عن الحمض النووي من الأنواع ذات الأهمية ، مما يسمح للمرء باستنتاج وجود الأنواع في المنطقة التي تم أخذ عينات منها. بسبب الحساسية الكبيرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، يمكن أن يحدث التلوث بسهولة ، وهناك حاجة إلى ضوابط سلبية لتحديد الخطوات التي تم فيها إدخال التلوث.

eDNA هو مجال مليء بالمصطلحات والمصطلحات المختصرة. بالنسبة لأولئك الذين لا يمارسون في البيولوجيا الجزيئية أو qPCR ، يمكن أن تساعد العروض التوضيحية المرئية في تخطيط التصميم التجريبي من التصور إلى توليد البيانات. سيوضح الإجراء دانيس رويز راموس ، عالم أحياء من مختبرنا ، وترودي فروست ، مساعد مختبر الطلاب.

للبدء ، ابحث وقم بتنزيل التسلسلات من مناطق جينية متعددة للأنواع ذات الأهمية باستخدام قاعدة بيانات النوكليوتيدات التابعة ل NCBI. حدد جميع التسلسلات التي تطابق المواصفات، وحدد إرسال إلى.اختر سجل كامل، ملف، تنسيق تنزيل إما GenBank أو FASTA، ثم إنشاء ملف. يتم الآن حفظ هذه التسلسلات على الكمبيوتر.

كرر هذه الخطوات لجميع الأنواع ذات الأهمية. احتفظ بالتسلسلات لكل منطقة جينية في ملف منفصل ، حيث سيتم تحليلها بشكل منفصل. لمحاذاة التسلسلات من كل منطقة جينية على حدة ، قم باستيراد ملفات التسلسل التي تم تنزيلها إلى برنامج محاذاة التسلسل ، مثل برنامج Geneious Prime.

قم بإنشاء مجلدات منفصلة لكل منطقة جينية ، ثم حدد جميع التسلسلات داخل مجلد يحتوي على تسلسلات من منطقة جينية واحدة. استخدم أداة المحاذاة المتعددة لإنشاء محاذاة نيوكليوتيدات، مثل Geneious أو MUSCLE للتسلسلات المحددة. اختر مناطق واعدة لتصميم الفحص من خلال تصور بيانات التسلسل المحاذاة.

حدد منطقة بها الكثير من بيانات التسلسل المتاحة للأنواع ذات الأهمية ، وتكون متباينة للغاية بين الأنواع ، وتظهر تباينا منخفضا داخل الأنواع. بعد ذلك ، قم بتصميم بادئات الفحص والمسبار. استخدم برنامج تصميم مقايسة qPCR لتصميم خمس مجموعات من فحوصات qPCR.

الصق التسلسل المحدد في مربع إدخال التسلسل. إذا أنشأت المحاذاة مسافات، فاحذفها من التسلسل. حدد مسبار بادئات qPCR 2 في خيار اختيار التصميم الخاص بك ، ثم قم بتنزيل المقايسات الموصى بها.

انسخ التسلسلات من التمهيدي الأمامي للمقايسة الأولى ، وابحث عن هذا التسلسل التمهيدي في المحاذاة التي تم إنشاؤها مسبقا. إذا كنت تستخدم Geneious Prime، فاستخدم أداة Annotate Predict لإضافة منطقة التمهيدي إلى المحاذاة. افعل ذلك لجميع مجموعات التمهيدي والمسبار.

افحص هذه المناطق من المحاذاة بحثا عن التباين داخل الأنواع المستهدفة ، وكذلك داخل الأنواع المتزامنة. اختبر الاشعال في السيليكو من خلال Primer-BLAST من NCBI. الصق الاشعال لاستخدام صندوق التمهيدي الخاص بي ضمن معلمات التمهيدي.

في خيارات معلمات التحقق من خصوصية زوج التمهيدي، حدد NR كقاعدة بيانات واكتب الترتيب التصنيفي أو عائلة الكائن الحي المعني في مربع الكائن الحي. تأكد من أن البادئات المختارة من غير المحتمل أن تضخم الأنواع غير المستهدفة. اختبر كفاءة الفحص في المختبر عن طريق إنشاء منحنى قياسي وتحديد كفاءة المنحنى ونطاقه الخطي.

اختبر ما لا يقل عن ستة تخفيفات بمقدار عشرة أضعاف لمعيار الحمض النووي الاصطناعي الذي يحتوي على التسلسل المستهدف ، بحوالي نسخة إلى مليون نسخة لكل تفاعل. استخدم برنامج qPCR لرسم قيمة CQ لكل معيار على المحور Y ، وقاعدة السجل 10 للتركيز القياسي الأولي في نسخ لكل تفاعل على المحور X. يجب أن يقوم برنامج qPCR بتشغيل انحدار خطي تلقائيا.

احسب الكفاءة من منحدر الانحدار. افحص المنحنى القياسي بصريا بحثا عن التحيز أو الأداء الضعيف ، كما تم قياسه بالكفاءة وقيم R التربيعية. استخدم عنصرا داخليا إيجابيا لاختبار تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل للعينات الميدانية الفعلية ، مما قد يؤدي إلى انخفاض الحساسية والسلبيات الكاذبة.

تحديد حدود الكشف والقياس الكمي لكل فحص. اختبر المقايسات مع الأنواع غير المستهدفة للتحقق من الخصوصية، وتأكد من أن الاختبار يعمل بشكل جيد مع مضاعفة الإرسال IPC. يمكن أن تنتقل المقايسات ذات الحساسية والخصوصية والكفاءة الجيدة إلى الخطوات التالية.

لإجراء اختبار في الموقع للفحص ، احصل على عينات مياه متعددة ومعالجتها من أجل qPCR. قم بإجراء مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وقارن تركيز الحمض النووي الإلكتروني وتكرار الكشف مع الاختلافات المعروفة في الموقع في الحدوث والوفرة. تأكد من جميع الاكتشافات عن طريق التسلسل.

تم تنزيل التسلسلات المتاحة لجميع أنواع Unionidae في نهر كلينش ومواءمتها. بعد تصميم فحوصات متعددة ، تمت إضافة خمس مجموعات من البادئات والمسبار إلى المحاذاة للتقييم البصري. تم اختبار مجموعات التمهيدي والمسبار في السيليكو وفي المختبر.

في المختبر ، تم اختبار جميع المقايسات باستخدام استخراج الحمض النووي ل 27 نوعا متاحا للتحقق من الخصوصية. نجح أحد المقايسات في تضخيم الأنواع المستهدفة فقط. يتم عرض اختبار ناجح بكفاءة جيدة وقيم R تربيعية هنا.

كل من LOD و LOQ للمقايسة المحددة خمس نسخ لكل تفاعل. في المقابل ، تم التخلص من المقايسات التي أنتجت منحنى قياسي بكفاءة ضعيفة. في qPCR عالي الجودة ، تتضخيم التخفيفات القياسية عند قيم القياس الكمي للدورة المتباعدة بشكل متساو تبلغ حوالي 3.3 دورة لكل فرق بمقدار عشرة أضعاف في التركيز.

في qPCR ضعيف ، قد تظهر المعايير تباينا غير متساو في قيم القياس الكمي للدورة بين التخفيفات. وينبغي مقارنة تضخيم التصنيف الدولي للعدوى ومكافآته للعينات غير المعروفة بنتائج التصنيف الدولي للتحكم في القالب السلبي. في حالة عدم وجود مثبطات في العينات ، يجب أن يكون لكل تضخيم IPC مجموعة ضيقة في المخطط ، مع قيم القياس الكمي للدورة تقريبا مثل التحكم في عدم وجود قالب.

بالنسبة للاختبار في الموقع للفحص ، تضمنت مواقع الموقع الجزء السفلي من قاع بلح البحر في التيار ، وأسفل قاع العضلات بالقرب من الشاطئ ، و 100 متر في اتجاه مجرى النهر من السرير في مجرى ، و 500 متر في اتجاه مجرى النهر من السرير في مجرى النهر ، و 500 متر في اتجاه مجرى النهر من السرير بالقرب من الشاطئ. يمكن أن تساعد فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية للحمض النووي البيئي في مراقبة كل من الأنواع الغازية والمهددة بالانقراض ، بالإضافة إلى تحسين فهمنا للتغيرات المكانية والزمانية في اكتشاف الأنواع دون الحاجة إلى التقاط الكائن الحي الفردي جسديا.